歐陽艷，馬 濤

（1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，湖北 宜昌 443000；2.湖北省宜昌市動物疫病預(yù)防控制中心，湖北 宜昌 443000）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）以妊娠母豬發(fā)生明顯的繁殖障礙以及仔豬出現(xiàn)嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病和生長遲緩為主要特征，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。2006年由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引發(fā)的豬“高熱病”給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的打擊。之后，2009年、2011年和2015年P(guān)RRS在我國都出現(xiàn)不同程度的暴發(fā)。此外，2015年來自美國的NADC30-like毒株在我國不同省份引發(fā)母豬嚴重的流產(chǎn)或早產(chǎn)[1]。筆者根據(jù)送檢病死仔豬的臨床癥狀、病理變化及實驗室檢測結(jié)果最終確診為豬繁殖與呼吸綜合征類NADC30-like毒株和HP-PRRSV毒株混合感染，現(xiàn)將診斷過程報道如下。

1 發(fā)病情況

湖南省汨羅縣一存欄400頭的保育豬場，2018年7月保育豬（40日齡）開始發(fā)病，死亡率高達20%。主要臨床癥狀為厭食、發(fā)燒、咳嗽和皮膚發(fā)紺等。發(fā)病后該豬場用氟苯尼考、金霉素和土霉素等藥物拌料進行治療，未見好轉(zhuǎn)。

圖1 發(fā)病豬及死亡豬臨床癥狀

2 剖檢變化

病理剖檢顯示，病死豬肺部發(fā)生大面積肉變，萎縮塌陷，失去彈性；體表淋巴結(jié)腫大，出血嚴重；腎臟表面有大量針尖大小出血點，切面顏色發(fā)黃，皮質(zhì)增厚，腎乳頭有少量出血點；脾臟腫大，邊緣有梗死。

圖2 病死豬臟器剖檢變化圖

3 實驗室檢查

3.1 細菌的分離培養(yǎng)

在無菌操作臺上用接種環(huán)分別對送檢豬肺臟、血液進行挑菌培養(yǎng)，接種于TSA培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃）過夜培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未形成菌落。

3.2 病毒的RT-PCR檢測

3.2.1 RNA的提取。采集病死豬的肺臟，適量取樣，勻漿器研磨10 min后收集勻漿，12000 r/min離心10 min，取上清液200 μL放入DEPC處理過的1.5 mL EP管中，然后每管加入1 mL Trizol裂解細胞，輕柔吹打，反復(fù)數(shù)次直至均勻。室溫放置5 min，加入200 μL氯仿，蓋緊蓋子在震搖器上渦旋震搖15 sec，充分混勻后冰浴10 min，使混合液分層；然后4℃ 12000 rpm離心 5 min，小心轉(zhuǎn)移 80%的上層液體（約 500～600 μL）到一個新的EP管中，加入與上清液等體積的異丙醇，混勻后室溫放置10 min，接著4℃ 12000 rpm離心10 min沉淀核酸；棄掉上清，沉淀用大于1倍Trizol體積的75%的乙醇洗滌，4℃ 7500 rpm離心5 min后小心將上清吸干，沉淀于室溫晾干 （5～10 min）后用DEPC處理過的滅菌水溶解，提取的RNA可小量分裝于-80℃低溫保存。

3.2.2 兩步法RT-PCR。第一步為cDNA的合成。

表1 RT反應(yīng)體系

上述體系與第一步反應(yīng)體系混勻，反應(yīng)條件為：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。 合成好的cDNA立即用于第二步PCR反應(yīng)。

第二步：特異性DNA片段的合成。

表2 PCR反應(yīng)體系

得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖電泳分離后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。病料中檢測出NADC30-like PRRSV與HP-PRRSV，見圖2。

4 診斷

根據(jù)臨床診斷、病理剖檢、細菌的分離培養(yǎng)及RT-PCR檢測，確診該豬場送檢患病豬為NADC30-like毒株與HP-PRRSV毒株混合感染。

表3 擴增目的基因的引物及大小

圖2 PRRSV NSP2基因部分片段擴增結(jié)果

5討論

近年來，豬藍耳病病毒仍然是豬呼吸道問題的主要因素，因豬藍耳病病毒具有高度的變異性，當(dāng)前藍耳病疫苗的接種對疫病的防控很難達到滿意的效果，且由于亂用疫苗，導(dǎo)致我國部分豬場出現(xiàn)PRRSV不同毒株混合感染的情況。另外從臨床檢測來看，NADC30-like PRRSV有逐漸擴大的趨勢。因此，豬場應(yīng)慎重選用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗免疫接種，高建華[2]認為對于疫情相對穩(wěn)定的豬場，一般不推薦使用高致病性豬繁殖與呼吸綜合征弱毒疫苗。周磊[3]認為采用生物安全控制措施、閉群技術(shù)、后備母豬馴化和PRRSV檢測與淘汰等措施綜合措施是防控 PRRS的明智之舉。