陳 宏，張佩穎，趙建云，王文增，張明浩，李可心，鄧琳千，宋倩男*

（1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，哈爾濱 150040）

肺纖維化（pulmonary Fibrosis，PF）是間質(zhì)性肺疾病（interstitial lung disease,ILD）常見的臨床病理改變；以成纖維細(xì)胞的大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集為主要病變特征[1]；呼吸衰竭是肺纖維化患者的最終臨床表現(xiàn)?；颊叩闹形簧鏁r(shí)間為2～3 年，5 年病死率達(dá)40%。肺纖維化的致病因素廣泛，空氣污染，各種粉塵，射線損傷，某些藥物和疾病及病毒感染（SARS及2019-nCoV）等均可以引起肺纖維化[2-3]?，F(xiàn)階段肺纖維化的治療依舊是臨床難題，其病因不明、發(fā)病機(jī)制不清楚，無法進(jìn)行有效的針對(duì)性治療[4-5]。過去的治療方式主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療為主[6]，越來越多的臨床研究數(shù)據(jù)表明，這些治療方法效果并不理想[5,7]。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步對(duì)橘皮苷對(duì)百草枯致肺纖維化小鼠細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化的干預(yù)作用及Fas/FasL 蛋白表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行研究，為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取同批飼養(yǎng)的雄性C57 小鼠60 只，體質(zhì)量（24.3±3.6）g，8～10 周齡，購于青龍山動(dòng)物繁殖中心[許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001]，飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度保持（23±1.5）℃，相對(duì)濕度保持（50±3.5）%，所有小鼠均給予相同的常規(guī)自由飲食。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠在潔凈級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。

1.2 藥品及試劑 橘皮苷（HES）（上海賢鼎生物科技有限公司），百靈威科技有限公司生產(chǎn)的百草枯（濃度＞98%），南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的蘇木精-伊紅染色、Masson 染色、一氧化氮合酶及還原性谷胱甘肽試劑盒，北京天根技術(shù)有限公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，北京方程生物科技有限公司生產(chǎn)的E-Cadherin，Vimentin，MMP2 和NF-κB 試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 TS100 型倒置顯微鏡及其配套圖像采集系統(tǒng)；Eppen-dorf 公司的5417R 高速低溫離心機(jī)和移液器，北京瑞麗分析儀器公司生產(chǎn)的UV9600 分光光度計(jì)，MJ Research 公司生產(chǎn)的PTC-200 型PCR 儀器。

1.4 方法

1.4.1 小鼠模型復(fù)制、分組及給藥 正常組注入等量生理鹽水（2 mg/kg），百草枯模型組利用百草枯水溶液灌胃建模。在建模后第1 周，給予小鼠藥物治療，地塞米松組采用腹腔注射方式按2 mg/（kg·d）劑量給予地塞米松，橘皮苷組每次用橘皮苷灌胃。每天給藥1 次，觀察小鼠的生活狀態(tài)及體質(zhì)量，給藥3 周后進(jìn)行藥效檢測(cè)。將60 只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為Blank組、Model 組、HES（H）組、HES（M）組、HES（L）組和DEX 組，每組10 只。

1.4.2 動(dòng)物標(biāo)本收集與處理 造模3 周后，將小鼠處死收集標(biāo)本，血液離心后將血清冷凍保存，檢測(cè)一氧化氮、谷胱甘肽等氧化指標(biāo)；將小鼠解剖后，分離其新鮮肺組織并稱重。小鼠左肺組織固定處理后，石蠟包埋并進(jìn)行切片處理，然后根據(jù)試劑說明進(jìn)行HE 染色及Masson 染色操作，并置于顯微鏡下進(jìn)行觀察記錄，小鼠右肺組織分置凍存管，迅速置入液氮罐后保存，觀察記錄相關(guān)因素水平指標(biāo)。

1.4.3 檢測(cè)方法 給藥3 周后，將各組小鼠稱重，然后進(jìn)行眼球靜脈叢取血每樣品1 mL，用于測(cè)定血漿中的TNF-α、IFN-γ、TGF-β1含量，肺臟組織 MDA、MPO 水平；取血后斷頸處死小鼠，取小鼠肺組織稱重，將左肺凍存于-80℃冰箱中，用于膠原百分含量的測(cè)定；將右肺組織經(jīng)10%福爾馬林固定，固定后用流水沖洗掉肺組織表面的固定液，常規(guī)脫水、制作石蠟組織切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色及MASSON染色。在顯微鏡下觀察肺組織的形態(tài)學(xué)變化以及膠原百分含量的變化。

1.4.4 Fas/FasL 免疫組化染色 按照生物素—鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行，將肺組織切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)15 min，以3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，血清封閉，滴加一抗 4 ℃過夜，PBS 沖洗，滴加二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，經(jīng) DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。鏡下觀察棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。每張玻片隨機(jī)計(jì)數(shù) 10 個(gè)視野，通過Image-Pro plus 5.1 半定量分析免疫組化的染色結(jié)果，以光密度值表示。

1.4.5 藥物對(duì)肺上皮細(xì)胞EMT-like 轉(zhuǎn)變的影響 由于EMT-like 轉(zhuǎn)變?cè)诜卫w維化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，本研究將關(guān)注橘皮苷對(duì)EMT-like 的影響，研究其對(duì)肺上皮細(xì)胞A549 的EMT-like 影響，并分析其對(duì)EMT-like 相關(guān)的信號(hào)通路（TGF-β1，NF-κB 等）的影響，確定其影響的主要信號(hào)通路。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)藥物對(duì)EMT-like 標(biāo)志物（E-Cadherin,Vimentin），MMP2，NF-κB 等的影響，分析其影響的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；并利用Western-blot 方法對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子的下游通路進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4.6 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 0 級(jí)，無肺間質(zhì)纖維化；1 級(jí)，輕度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍局限在全肺20%以下；2 級(jí)，中度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍占全肺的20%～50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；3 級(jí)，重度肺間質(zhì)纖維化，病變范圍＞50%，肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 將收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，予t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，予χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 肺纖維化建模后，開始給藥橘皮苷，連續(xù)給藥4 周。將小鼠的肺組織解剖后進(jìn)行HE 染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的肺組織嚴(yán)重破壞，肺泡結(jié)構(gòu)消失，大量纖維組織增生；與肺纖維化模型組相比，給藥橘皮苷組小鼠的肺組織肺纖維化程度明顯改善，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)更加完整。見圖1，圖2。

圖1 橘皮苷給藥第4 周肺組織染色結(jié)果（HE，×400）

圖2 橘皮苷給藥第4 周肺組織染色結(jié)果（Masson，×400）

2.2 橘皮苷對(duì)肺纖維化中關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 利用免疫組化的方法，對(duì)肺纖維化中的關(guān)鍵信號(hào)通路如EMT-like 標(biāo)志物（E-Cadherin,Vimentin），MMP2，NF-κB 等的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)橘皮苷可以抑制EMT-like 過程，增加MMP2 的表達(dá)，抑制NF-κB 的表達(dá)。見圖3。

圖3 橘皮苷對(duì)肺纖維化中關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響

2.3 橘皮苷對(duì)百草枯致小鼠肺組織 Fas/FasL 表達(dá)的影響 細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色顆粒表達(dá)的細(xì)胞即為 Fas/FasL表達(dá)陽性細(xì)胞，Model 組見肺組織陽性細(xì)胞明顯增多，F(xiàn)as 主要表達(dá)在肺泡上皮細(xì)胞，F(xiàn)asL 主要表達(dá)在肺泡上皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞、部分間質(zhì)細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞，Blank 組只有少量的陽性細(xì)胞。與Model 組相比，HES（H）組、HES（M）組、HES（L）組和DEX 組有顯著性差異（P＜0.01），采用橘皮苷（HES）發(fā)現(xiàn)，HES（H）組、HES（M）組、HES（L）組和DEX 組肺組織 Fas/FasL 表達(dá)明顯減少，HES（H）組與HES（M）組、HES（L）組和DEX 組比較差異顯著（P＜0.05）。見表1。

表1 橘皮苷對(duì)百草枯致小鼠肺組織 Fas/FasL 表達(dá)影響（，n =10）

表1 橘皮苷對(duì)百草枯致小鼠肺組織 Fas/FasL 表達(dá)影響（，n =10）

注：與Blank 組比較，## P ＜0.01，# P ＜0.05；與Model 組比較，△P ＜0.05；與HES（M）組和HES（L）組比較，▲P ＜0.05

3 討論

根據(jù)最新的治療指南（2015 版），目前臨床用于治療IPF 的藥物主要為吡非尼酮及多重酪氨酸激酶抑制劑尼達(dá)尼布（有條件的推薦使用）[8-9]；其次為N-乙酰半胱氨酸、雙重內(nèi)皮素受體抑制劑波生坦以及馬西替坦（有條件的不推薦使用）[9]。這些藥物存在著不同程度的副作用并且治療效果并不理想。此外，上述藥物臨床治療費(fèi)用較高，每人每年可達(dá)數(shù)萬元，患者負(fù)擔(dān)較重[10-11]。因此，從中藥單體中尋找抗肺纖維化的有效成分，并且闡明其藥理機(jī)制，對(duì)于其臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)具有重要的意義。藥物開發(fā)成功將具有重大的社會(huì)意義。

橘皮苷，即維生素P 黃酮類化合物之一，主要存在于柑橘屬果實(shí)中，尤其是柑、橘、甜橙和檸檬等的果皮中含量較多[12]。分離提取的橙皮苷精制品為白色粉末，微小針狀晶體。橘皮苷是維生素P 的重要組成部分，具有軟化血管的作用。本研究成功建立了百草枯誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的模型及百草枯及病毒誘導(dǎo)的肺纖維化模型，并且建立了完善的肺纖維化藥效評(píng)價(jià)體系，包括細(xì)胞因子檢測(cè)，HE 染色及纖維化程度評(píng)分，膠原含量檢測(cè)等。本研究結(jié)果顯示，中草藥植物的萃取物因其富含多酚類與多樣的藥理特性，而被用于抗炎、抑菌，柑橘類植物中富含的類黃酮素多酚（flavonoid），傳統(tǒng)中藥中陳皮也富含此成分，研究證實(shí)橘皮苷具有抗輻射傷害、抗過敏、抗菌、抗氧化的多種藥理作用。相關(guān)研究[13]認(rèn)為橘皮苷能夠抑制許多前發(fā)炎細(xì)胞激素包含IL-6、IL-1β 以及iNOS，因此有相當(dāng)?shù)臐摿梢种蒲装Y與破壞。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），又被稱為matrixins，由多個(gè)同源內(nèi)勝肽酶家族組成，此類蛋白質(zhì)具有分解細(xì)胞外基質(zhì)功能，結(jié)構(gòu)上具有多段相似的構(gòu)造以及帶有金屬離子的催化分解區(qū)域，進(jìn)行生理作用時(shí)對(duì)于鋅和鈣離子依賴性高，這些金屬離子能夠幫助穩(wěn)定酵素的立體結(jié)構(gòu)；大多數(shù)細(xì)胞可以制造數(shù)種MMP，大部分MMP 初始以前酶原形式被制造出來，此階段蛋白不具有酵素活性，需要通過活化才具備活性。正常情況下MMP 活性受到嚴(yán)格調(diào)控，以防止過度的蛋白分解造成組織的破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，橘皮苷能夠增加MMP2 的表達(dá)。

Fas 是腫瘤壞死因子受體（TNFR）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）受體家族的細(xì)胞表面分子，F(xiàn)as 配體（Fas ligand，F(xiàn)asL）是TNF 家族的細(xì)胞表面分子。FasL 與其受體Fas 結(jié)合導(dǎo)致攜帶Fas 的細(xì)胞凋亡。研究表明，多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)Fas，而FasL 僅表達(dá)于活化的T 細(xì)胞。在免疫系統(tǒng)中，F(xiàn)as 和FasL 參與反應(yīng)的下調(diào)及T 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Fas 和FasL 可因基因突變而喪失功能，導(dǎo)致淋巴增殖性疾病發(fā)生以及自身免疫加劇，因此系統(tǒng)的功能過強(qiáng)可導(dǎo)致組織破壞。Fas 是人們?cè)谘芯磕さ鞍卓贵w的溶細(xì)胞作用時(shí)被發(fā)現(xiàn)的，進(jìn)而從細(xì)胞溶T 細(xì)胞系分離了Fas 的配體FasL，從而建立了Fa/FasL 細(xì)胞凋亡信息傳遞系統(tǒng)。因此，橘皮苷對(duì)于百草枯（PQ）導(dǎo)致的小鼠肺纖維化具有保護(hù)作用，降低Fas/FasL 表達(dá)，表明橘皮苷對(duì)百草枯致肺纖維小鼠纖維化改善與 Fas/FasL 凋亡通路有關(guān)。