浦恩念，高子厚*，李玉瓊，邵宗體，杜春紅，段興德，劉正祥

(1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000；2.云南省地方病防治所，云南大理671000)

大絨鼠Eothenomys miletus隸屬于倉(cāng)鼠科Cricetidae絨鼠屬，在云南省分布廣泛(羅澤珣，2000)，是云南野鼠鼠疫自然疫源地的主要儲(chǔ)存和流行宿主動(dòng)物之一。云南省特殊的地理環(huán)境和氣候條件，可能導(dǎo)致了大絨鼠形態(tài)特征不穩(wěn)定、同種異型和近緣種形態(tài)特征相似等問(wèn)題：王應(yīng)祥(2003)將大絨鼠分為2個(gè)地理亞種：指名亞種E.m.miletus和怒江亞種E.m.confinii；整個(gè)絨鼠屬的系統(tǒng)關(guān)系及分類地位尚存爭(zhēng)議(劉少英，劉洋，2005)。因此，云南不同地理位置和氣候環(huán)境中分布的大絨鼠的遺傳多樣性與遺傳分化值得研究和探討。

動(dòng)物線粒體DNA(mtDNA)分子小而穩(wěn)定、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特征(Birkyetal.，1989)，已成為遺傳多樣性研究的一個(gè)強(qiáng)有力的工具，它包含的細(xì)胞色素b(cyt b)基因是研究物種地理變異問(wèn)題最可信的線粒體DNA標(biāo)記之一(李楠楠等，2012)。一些學(xué)者對(duì)大絨鼠的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步研究(沐遠(yuǎn)等，2015；Muetal.，2019)，但尚未對(duì)其他區(qū)域分布的大絨鼠的遺傳信息進(jìn)行比較分析，本文對(duì)云南7個(gè)地區(qū)的大絨鼠cyt b基因進(jìn)行檢測(cè)分析，為大絨鼠乃至絨鼠屬的系統(tǒng)研究提供分子數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集、鑒定和保存

本研究從玉龍縣、劍川縣、祥云縣、大理市、巧家縣、祿勸縣、騰沖市的7個(gè)采樣點(diǎn)共采集到大絨鼠140只(表1)。利用鼠夾從采樣點(diǎn)的農(nóng)田及灌木叢中捕獲大絨鼠，捕獲個(gè)體按形態(tài)學(xué)特征，并剝制頭骨標(biāo)本進(jìn)行鑒定，取肌肉保存于95%乙醇中，-20 ℃保存。

表1 云南7個(gè)采樣點(diǎn)的大絨鼠樣品采樣信息 Table 1 Sampling information of Eothenomys miletus in 7 localities of Yunnan Province

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

用肌肉標(biāo)本按照QIAGEN試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)步驟提取基因組DNA。cyt b的PCR擴(kuò)增使用哺乳動(dòng)物通用引物L(fēng)14724：5’-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’，H15915R：5’-GGAATTCATCTCTCCGGTTTACAAGAC-3’；擴(kuò)增體系為25 μL：模板2 μL，10 μmol·L-1引物各0.5 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。實(shí)驗(yàn)過(guò)程以水作為空白對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.3 序列分析

利用Clustal X(Thompsonetal.，1997)對(duì)測(cè)序獲得的有效樣本序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA 5(Tamuraetal.，2011)基于Kimura雙參數(shù)距離模型計(jì)算堿基組成、轉(zhuǎn)換與顛換值；以齊氏姬鼠Apodemus chevrieri(GenBank登錄號(hào)：AB096821)為外群，基于類平均法(UPGMA)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，各分支的自舉檢驗(yàn)值由1 000次重復(fù)檢驗(yàn)所得。利用Dnasp 5.0(Rozasetal.，2003)計(jì)算單倍型數(shù)目、變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和基因流(Nm)。其中，Nm<1表明群體間可能由于遺傳漂變而發(fā)生分化；Nm>1表明群體間的基因流水平較高，群體間遺傳分化較小。利用PopART(Leigh &Bryant，2015)基于中連法(Median joining method)構(gòu)建大絨鼠單倍型間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。運(yùn)用Arlequin 3.1(Excoffieretal.，1992)計(jì)算遺傳分化系數(shù)(Fst)，進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)。通過(guò)IBD 1.53(Bohonak，2002)檢測(cè)地理距離與遺傳距離的相關(guān)性，用Fst值表示遺傳距離，地理距離采用采樣點(diǎn)間的地球表面直線距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)非特異性條帶，共獲得140只大絨鼠的擴(kuò)增條帶，部分樣本擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 cyt b基因序列分析

共獲得140只大絨鼠樣本cyt b基因部分序列(GenBank登錄號(hào)：MW567503～MW567642)，在1 027 bp的序列中，共有核苷酸變異位點(diǎn)128個(gè)，包含單變異位點(diǎn)109個(gè)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)19個(gè)，轉(zhuǎn)換和顛換(TS/TV)比為2.0，A、T、G、C平均堿基組成分別為：29%、27%、30.4%、13.6%，A+T含量顯著高于G+C含量。109個(gè)變異位點(diǎn)共定義51種單倍型，分別命名為Hap1～Hap51。

2.3 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

7個(gè)采樣點(diǎn)大絨鼠的單倍型多樣性為0.711～0.907，核苷酸多樣性為0.002 25～0.002 98，整體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.977±0.004和0.018 45±0.001 78。所有種群均為高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式。Hap20為大理、祥云、劍川種群共享，Hap21、Hap22、Hap24為大理、祥云種群共享，其余47個(gè)單倍型為各個(gè)種群特有(表2)。玉龍和劍川種群的單倍型多樣性相對(duì)較高，巧家種群的核苷酸多樣性最高(表3)。

表2 云南7個(gè)采樣點(diǎn)的大絨鼠單倍型分布Table 2 Haplotype distribution of Eothenomys miletus from 7 localities of Yunnan Province based on cyt b gene

表3 云南7個(gè)采樣點(diǎn)的大絨鼠cyt b基因的變異位點(diǎn)及遺傳多樣性Table 3 Variable sites and genetic diversity of Eothenomys miletus populations from 7 localities of Yunnan Province based on cyt b gene

2.4 種群間遺傳分化

種群間遺傳差異分析結(jié)果顯示，7個(gè)地理種群的Fst值為0.179 68～0.949 45，遺傳差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表4)。分子變異分析(AMOVA)結(jié)果表明，群體間的遺傳變異為84.29%，群體內(nèi)的為15.71%。種群間的基因流為0.026 62～2.282 72，除玉龍、祥云、劍川、大理4個(gè)地理距離較近種群之間的Nm值大于1之外，其他均小于1，且值均較低(表5)。

表4 云南7個(gè)采樣點(diǎn)的大絨鼠地理種群間的遺傳分化指數(shù)(下三角)與地理距離(km)(上三角)Table 4 Genetic differentiation (below diagonal) and geographical distances (km)(above diagonal) between Eothenomys miletus populations from 7 localities of Yunnan Province

表5 云南7個(gè)采樣點(diǎn)的大絨鼠cyt b基因的分子變異分析Table 5 AMOVA analysis for the cyt b sequences of Eothenomys miletus from 7 localities of Yunnan Province

表6 云南7個(gè)大絨鼠種群間的基因流Table 6 Matrix of population pairwise migration rate values between Eothenomys miletus populations from 7 localities of Yunnan Province

2.5 單倍型系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

采用UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，7個(gè)采樣點(diǎn)的大絨鼠種群分化為4個(gè)地域分支(圖2)，第一分支包括玉龍、祥云、劍川、大理的單倍型，第二分支為祿勸的單倍型，第三分支為巧家單倍型，第四分支為騰沖單倍型。單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示出與進(jìn)化樹(shù)相同的結(jié)果(圖3)，大絨鼠已經(jīng)出現(xiàn)了地理種群分化。

2.6 IBD檢驗(yàn)

通過(guò)IBD1.53對(duì)大絨鼠7個(gè)地理種群間的地理距離與遺傳距離進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，地理距離與遺傳距離之間呈顯著的正相關(guān)(r=0.699 7，P<0.05，R2=0.49)。

3 討論

遺傳多樣性的高低與物種的適應(yīng)能力、生存能力密切相關(guān)(季維智等，1999；Frankhametal.，2010)，本研究中大絨鼠單倍型多樣性為0.977±0.004，核苷酸多樣性為0.018 45±0.001 78，多樣性水平與其常同域分布的齊氏姬鼠相當(dāng)(朱萬(wàn)龍等，2013)，玉龍和劍川大絨鼠種群?jiǎn)伪缎投鄻有愿哂谄渌N群，大絨鼠在這些地區(qū)小獸中的構(gòu)成比也較高，說(shuō)明大絨鼠在這些地區(qū)的適應(yīng)能力和生存能力較強(qiáng)。大絨鼠種群總體表現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的特點(diǎn)，Yuan等(2012)認(rèn)為高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性主要與單個(gè)堿基的變異、地理種群處于擴(kuò)張有關(guān)，大絨鼠種群總體表現(xiàn)出高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性的特點(diǎn)可能也與這2種原因有關(guān)。

基因分化系數(shù)和基因流是衡量遺傳分化的重要指標(biāo)(Nei，1987)，F(xiàn)st值為0.15～0.25時(shí)說(shuō)明遺傳分化較大(Wright，1965)，基于線粒體cyt b序列的AMOVA分析結(jié)果顯示，大絨鼠各地理種群間遺傳分化指數(shù)為0.179 68～0.949 45，表明云南地區(qū)大絨鼠各地理種群間存在明顯的遺傳分化。大絨鼠7個(gè)地理種群間基因流為0.026 62～2.282 72，玉龍、祥云、劍川、大理4個(gè)地理距離較近種群組合之間的Nm值大于1之外，其他種群組合間均小于1，且值均較低，說(shuō)明多數(shù)種群間基因流水平貧乏。在單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，大絨鼠種群分化為4個(gè)地域分支，玉龍、祥云、劍川、大理為一分支，其他種群分別獨(dú)立為一支，在實(shí)際的地理位置中，玉龍、劍川、大理、祥云的地理距離較近，而騰沖、巧家、祿勸與其他幾個(gè)地區(qū)距離較遠(yuǎn)。單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示出與進(jìn)化樹(shù)相同的結(jié)果，綜合研究結(jié)果表明大絨鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的種群分化。

遺傳分化的程度會(huì)隨著地理距離的增加而增加(Floydetal.，2005)，IBD檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)st與地理距離呈顯著正相關(guān)，大絨鼠種群間遺傳分化中49.0%的變異可以用地理隔離解釋，這表明種群間地理隔離對(duì)遺傳分化起重要作用，這可能與大絨鼠的遷移擴(kuò)散能力較弱有關(guān)。云南氣候多樣，山川河流縱橫，地形地勢(shì)復(fù)雜，獨(dú)特的生境可能造成大絨鼠種群間的地理隔離，是否因地理隔離形成獨(dú)立的亞種還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，云南地區(qū)大絨鼠高單倍型多樣性、低核苷酸多樣性，以及種群間高遺傳分化的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可能與其生物學(xué)特征和擴(kuò)散能力等因素有關(guān)，同時(shí)地理距離隔離對(duì)其遺傳分化起了重要作用。然而，由于本研究?jī)H用了線粒體cyt b基因作為分子標(biāo)記，可能存在局限性，欲全面了解大絨鼠的遺傳多樣性、遺傳分化程度，還需要擴(kuò)大大絨鼠采樣范圍，加入微衛(wèi)星、核基因等標(biāo)記的分析，進(jìn)一步研究。