陳沙，劉煥章，曹文宣，俞丹*

(1.大連海洋大學，遼寧大連116023；2.中國科學院水生生物研究所，水生生物多樣性與保護重點實驗室，武漢430072)

透明帶(zona pellucida，ZP)是包圍在卵母細胞或早期胚胎外的一層糖蛋白，通常被稱為透明帶蛋白(ZP蛋白)，通常由3、4種糖蛋白組成，受ZP基因家族編碼表達(Goudetetal.，2008)。ZP基因中除ZP結構域外，通常還包含N端信號肽序列、弗林蛋白酶切割位點、跨膜結構域、三葉草結構域或EGF結構域(Wassarman &Litscher，2004)。硬骨魚類基因組經歷過特有的基因組復制，因此基因組上存在著大量的ZP蛋白編碼基因，被復制的基因在魚類中可能演化出新的功能，比如南極魚Patagonotothen ramsayi的ZP蛋白被證實是抗凍蛋白(馬戰(zhàn)領，2015；Caoetal.，2016)。除了抗凍功能，ZP蛋白在魚類中是否還有其他功能尚不清楚。

ZP2基因是ZP基因家族的重要成員，除了含有保守的三葉草結構域和ZP結構域外，還有1個富含脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)殘基的N端重復結構域(Wang &Gong，1999)。Lyons等(1993)克隆獲得了美洲擬鰈Pseudopleuronectes americanus的ZP2基因序列，發(fā)現(xiàn)其重復結構域的重復單元為(PQQPQQPQQPQQPKY)7。隨后，發(fā)現(xiàn)鯉Cyprinus carpio的重復單元為(QQTSQQFQPQKPA/V)13(Changetal.，1997)；稀有鯽Gobiocypris rarus的重復單元為(VQQQASQQFPQR/Q)(12～19)(Wuetal.，2012)；鯽Carassius auratus的重復單元為(QQPKQFPF/LQKPVP)7(史建伍，2014)。Wang和Gong(1999)首次在斑馬魚Daniorerio上克隆到了ZP2基因序列，但此基因沒有含P和Q的重復結構域。同樣，在青鳉Oryzias latipes、日本鰻鱺Anguilla japonica中也沒有發(fā)現(xiàn)重復結構域(Kanamorietal.，2003；Sanoetal.，2010)。已有研究表明，ZP2基因重復結構域的重復序列在受精后的谷氨酰胺的γ-羰基和賴氨酸的ε-氨基之間會形成分子間交聯(lián)，從而參與魚卵卵膜的硬化(Oppen-Berntsenetal.，1990；Giaccoetal.，2000)。但這些串聯(lián)重復單元是否具有其他功能尚不清楚，例如是否與魚類的產卵習性相關。

鯉形目Cypriniformes魚類約4 200種，是世界上最大的淡水魚類類群(Nelsonetal.，2016)，廣泛分布在除南極洲、南美洲和澳大利亞以外的世界各大洲。鯉形目魚類起源于193 Ma的侏羅紀(Taoetal.，2019)，并演化出了豐富多樣的產卵習性。例如，為適應東亞季風氣候的特點，鯉形目魚類演化出了產漂流性卵習性的類群，并成為了河流、湖泊的主體和特色類群，該類群在水位連續(xù)上漲、水流刺激時產卵，卵隨水漂流，孵化發(fā)育；相反，產粘性卵習性的類群繁殖喜歡穩(wěn)定的環(huán)境，受精卵粘附于植物等基質上固著發(fā)育，水位上漲是產卵的刺激因素，多在近岸淺水處產卵；而產沉性卵習性類群的受精卵通常沉于水底發(fā)育，多在江河上游水質清澈、砂礫地質處產卵(解涵等，2010)。這種繁殖產卵方式的分化，對于魚類的物種多樣性的形成具有重要作用，但其相關的分子機制尚缺乏研究。Mansour等(2009)研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白是鯉卵表面具有粘性的主要原因，而編碼這類糖蛋白的正是ZP基因家族。因此，本研究將以鯉形目不同產卵習性的代表性魚類為研究對象，利用RT-PCR技術克隆ZP2基因，探討ZP2基因重復結構域的變異與鯉形目魚類產卵習性的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究的克隆對象包含10種鯉形目魚類，其中，產漂流性卵7種、產粘性或沉性卵3種(表1)。此外，在GenBank上下載其他4種鯉形目魚類、美洲擬鰈和青鳉的ZP2基因作為外類群。

表1 鯉形目魚類的產卵習性及ZP2基因序列來源Table 1 Spawning types of Cypriniformes and GenBank accession numbers of ZP2 gene

1.2 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

按照動物組織RNA提取試劑盒操作流程提取卵巢和肝臟的總RNA。提取的總RNA直接進行逆轉錄反應。反應體積為20 μL：總RNA為2 μL，Oligo(dt)18 Primer試劑1 μL和Nuclease-free水 9 μL，65 ℃ 5 min，然后向反應產物加5×Reaction Buffer 4 μL、Ribolok RNase Inhibitor 1 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL和RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL。最后在PCR儀中進行42 ℃ 60 min，25 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min。

1.3 ZP2基因克隆

根據GenBank中已發(fā)表的其他魚類的ZP2基因序列設計了6對同源PCR引物(表2)，克隆10種鯉形目魚類的ZP2基因的cDNA序列。反應體積為50 μL：16 μL Nuclease-free水，25 μL Buffer，1 μL dNTP，正、反引物各2 μL，1 μL Super Fidelity DNA Polymerase和3 μL cDNA。擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。產物經1%瓊脂糖凝膠檢測后，目的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司克隆測序。

表2 本研究相關的引物Table 2 Primers used in this study

1.4 ZP2基因生物信息學分析

將克隆獲得的cDNA序列在NCBI作BLAST比對分析，通過在線軟件ExPASy推測不同ZP2基因的開放閱讀框，使用在線軟件EMBOSS explorer預測氨基酸序列。利用ExPASy分析ZP2基因的相對分子質量、等電點等特征，使用在線軟件SMART分析氨基酸序列結構，并用DNAMAN對得到的序列進行同源性分析。采用在線工具SOPMA分析ZP2蛋白的二級結構及各成分的占比。通過Phyre2同源建模預測ZP2的三維結構模型。利用MEGA 7.0采用鄰接法(Neighbor-Joining)構建魚類ZP2基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。最后，通過EasyCodeML檢測ZP2基因的受選擇壓力情況，用非同義替代率(nonsynonymous substitution rate，dN)與同義替代率(synonymous substitution rate，dS)的比值ω(ω=dN/dS)估算選擇壓力(Gaoetal.，2019)。

2 結果與分析

2.1 ZP2基因序列分析

根據RT-PCR方法，克隆擴增獲得了10種鯉形目魚類的ZP2基因的cDNA全長序列。同時獲得了完整的開放閱讀框，序列全長1 254～1 734 bp，編碼了417～577個氨基酸，相對分子量為45.556～63.729 kDa，理論等電點為4.78～5.86(表3)。

表3 ZP2基因的序列信息Table 3 Sequence information of ZP2 gene

2.2 ZP2基因結構分析

10種鯉形目魚類的ZP2基因均含有N端信號肽序列、三葉草結構域、ZP結構域和弗林蛋白酶切割位點，但都不含跨膜結構域(圖1)。產粘性卵魚類的重復結構域中含有重復次數較多的重復單元(7～19次)，如團頭魴(15次)、稀有鯽(12～19次)，每個物種的重復單元序列存在差異(圖1；表4)。產漂流性卵和產沉性卵魚類不含重復結構域或重復單元重復次數較少(2～5次)，如：翹嘴鲌、銀、光唇蛇、鳊、銀鲴和寬鰭重復單元重復次數較少；犁頭鰍、似鳊和蒙古鲌不含重復結構域。

表4 ZP2基因重復結構域的重復單元及重復次數Table 4 Repeat unit and its number in the repeat domain of ZP2 gene

2.3 ZP2氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育關系分析

根據克隆獲得的ZP2基因氨基酸序列，分析鯉形目魚類的ZP2基因的同源性(圖2)。所有物種的ZP2氨基酸序列包含了18個保守的半胱氨酸殘基(6個位于三葉草結構域中、12個位于ZP結構域中)。ZP2氨基酸保守區(qū)域集中在N端信號肽序列、三葉草結構域和ZP結構域(圖2)。團頭魴與鳊的相似性最高(99.7%)，斑馬魚和鯽的相似性最低(71.2%)。以美洲擬鰈和青鳉作為外類群，在系統(tǒng)發(fā)育樹上，所有鯉形目魚類的ZP2氨基酸序列構成一個單系(圖3)，其中斑馬魚單獨為一支，位于系統(tǒng)樹的基部位置，與其他鯉形目魚類形成姐妹群。

2.4 ZP2蛋白二級結構分析

通過SPOMA對不同鯉形目魚類的ZP2蛋白進行二級結構預測，結果表明：二級結構主要由α-螺旋(10.58%～27.38%)、β-轉角(2.05%～3.60%)、延伸鏈(18.37%～26.79%)和無規(guī)則卷曲(49.61%～63.49%)組成，不同物種間的各成分所占比例各不相同(表5)，不同物種的ZP2蛋白二級結構具有一定的差異(圖4)。

表5 10種鯉形目魚類的ZP2蛋白二級結構相關參數Table 5 Secondary structure parameters of ZP2 protein of 10 Cypriniformes species

2.5 ZP2蛋白三維結構預測分析

通過Phyre2同源建模得到了鯉形目魚類ZP2蛋白的三維結構模型，不同物種的置信度均為100%，均顯示最大程度與數據庫中的小鼠MusmusculusZP2晶體結構模板匹配，預測模型與模板匹配相似度為38%～41%。構建三維模型時，不同物種的入模氨基酸范圍和數目存在差異，且入模的氨基酸也存在變異位點(表6)，進而導致不同物種的三維結構存在細微的差異(圖5)。

表6 10種鯉形目魚類的ZP2蛋白三維結構建模相關參數Table 6 Three-dimensional structural parameters of ZP2 protein in 10 Cypriniformes species

2.6 ZP2基因選擇壓力分析

利用位點模型的M1a和M2a、M7和M8，分支模型的two-ration和one-ration，分支-位點模型的model A和model A-null對魚類的ZP2基因進行正向壓力選擇分析(表7)。結果表明，M0模型中，所有位點的平均ω為0.21，魚類的ZP2基因整體受到純化選擇的影響；分支模型(two-ration)和M0模型中，似然比檢驗差異顯著(P<0.05)，說明ZP2基因的氨基酸位點經歷了不同的選擇壓力；M1a和M2a似然比檢驗差異不顯著(P>0.05)，認為有79%的位點受到純化選擇(ω=0.11)，而其他位點處于中性進化狀態(tài)；M7和M8似然比檢驗差異顯著(P<0.05)，表明大部分位點受到正向選擇(ω=1.91)，位點的概率經過BEB檢驗，總共檢驗出 9個后驗概率大于0.5的正選擇氨基酸位點(8 V 0.864、19 L 0.648、43 P 0.835、97 R 0.813、132 G 0.553、258 R 0.612、320 A 0.600、344 T 0.787、350 V 0.950)，其中第350位的氨基酸位點(350 V)在5%的置信水平顯著，后驗概率為95%；在分支-位點模型的檢測中，將鯉形目魚類指定為前景分支，似然比檢驗在備擇假設和零假設中沒有顯著差異(P>0.05)，沒有檢驗到正向選擇位點。

表7 EasyCodeML計算的各個模型的似然值及參數Table 7 Likelihood values and parameters of each model calculated by EasyCodeML

3 討論

3.1 鯉形目代表性魚類的ZP2基因結構特性

本研究發(fā)現(xiàn)10種鯉形目魚類的ZP2基因結構均符合ZP基因家族的特征，含有保守的N端信號肽序列、三葉草結構域、ZP結構域和弗林蛋白酶切割位點。ZP2基因是ZP基因家族的重要成員之一，它含有許多參與ZP蛋白分泌和組裝的保守功能域。其中,N端信號肽序列可以使正在翻譯的核糖體附著到內質網膜上合成并分泌蛋白(Blobel，1975);三葉草結構域的功能在于抗蛋白的水解消化(Bork，1993);ZP結構域是ZP蛋白的主要功能結構域，由大約260個氨基酸殘基組成，其中ZP2基因的ZP結構域有10個保守的半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基之間的二硫鍵對ZP結構域的立體折疊和蛋白之間的相互作用有著決定性的作用，起著聚合作用，可以參與ZP蛋白聚合成高階結構，如纖維和基質，此外，ZP結構域通常包含著ZP-N和ZP-C結構合成纖維，ZP-C總是與ZP-N相關聯(lián)，并且可能具有其他重要的功能，如調節(jié)不同亞基之間特異性的相互作用；弗林蛋白酶切割位點主要參與ZP蛋白的分泌，在哺乳動物中，它可以啟動蛋白質的聚合和組裝(Bork &Sander，1992；Jovineetal.，2002，2004，2005，2006；Sasanamietal.，2006；Kanaietal.，2010)。本研究克隆獲得的10種鯉形目魚類的ZP2基因均含有上述4種結構域。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)10種鯉形目魚類均不含跨膜結構域，有研究認為魚類的ZP蛋白最初是具有跨膜結構域的，但在進化過程中丟失了，但所有哺乳動物的ZP蛋白均包含1個跨膜結構域，該結構域的作用是錨定ZP蛋白到細胞膜上進行組裝(Wassarman &Litscher，2004；Sanoetal.，2010)。ZP2基因結構在哺乳動物和魚類中的差異暗示著ZP蛋白在哺乳動物和魚類中的功能存在不同。

3.2 鯉形目代表性魚類ZP2基因的重復結構域

分析目前所有已獲得的鯉形目魚類ZP2基因序列，發(fā)現(xiàn)不同物種間存在較大的序列長度差異(1 254～1 734 bp)，該差異主要來源于重復結構域的有無及重復單元和重復次數的不同，即是否存在串聯(lián)重復序列或串聯(lián)重復序列的長度是否存在差異，由此導致鯉形目魚類的ZP2蛋白二級結構組分及其空間結構存在一定的差異?；虻闹貜徒Y構域研究受到越來越多的關注。Charlesworth等(1994)已經證明重復序列可直接參與重組。當重組發(fā)生在重復結構域的不同位置時，姐妹染色單體之間或同源染色體之間會發(fā)生不均勻的交換，從而導致重復結構域的延長和縮短(Changetal.，1997)。但不是所有物種都有重復結構域，缺少重復結構域可能是該結構域的二次缺失，相反，重復結構域也可能發(fā)生平行或趨同進化，明顯不一致的重復結構域的存在表明它們的快速進化，重復單元可以通過DNA的復制或連續(xù)不均勻交叉而形成或消除，但是重復結構域的作用與功能需要進一步研究(Lewin，2000；Kanamorietal.，2003)。重復序列能參與遺傳物質結構的改變、基因調控以及細胞分化等過程，有的還可以直接編碼蛋白質(王劍波，蔣左庶，1992)。一般來說，具有重復序列的基因容易發(fā)生缺失，缺失是基因組進化差異的主要驅動力之一，因為重復序列的缺失可能會導致相應蛋白質的三維結構發(fā)生變異，Guo等(2012)通過對HOMOLENS數據庫中斑馬魚、三刺魚Gasterosteus aculeatus、青鳉、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes、綠河鲀Tetraodon nigroviridis的分析，發(fā)現(xiàn)重復序列的缺失對蛋白質的三維結構有著很大的影響；也可能通過改變翻譯閱讀框來誘導蛋白質的功能發(fā)生變化(Raes &Peer，2005)。魚卵粘性的產生是一個緩慢、持續(xù)時間最少為5 min的生理過程，皮層小泡釋放的糖蛋白(主要由ZP基因家族編碼)參與了卵粘性的生成(Chang &Huang，2002；Gallianoetal.，2003；Mansouretal.，2009)。此外，卵子在受精后，卵膜隨后會發(fā)生硬化，有研究認為卵膜的硬化可分為2步：首先金屬蛋白酶水解ZP2的N端脯氨酸和谷氨酰胺(Pro-Gln)區(qū)域，其次谷氨酰胺轉移酶會催化水解ZP2和ZP3發(fā)生分子交聯(lián)(Sugiyama &Iuchi，2000；Shibataetal.，2012)。Wu等(2012)也認為重復單元的重復次數可以影響硬骨魚卵膜的硬度，重復單元的重復次數越多，卵膜就越堅硬。本研究通過比較鯉形目代表性魚類重復結構域中重復單元的重復次數，發(fā)現(xiàn)其重復結構域與其產卵習性存在一定程度的相關性，例如產漂流性卵(7種)和產沉性卵魚類(3種)不存在重復結構域或重復單元的重復次數較少(2～5次)，而產粘性卵魚類(4種)的重復單元的重復次數較多(7～19次)，推測產漂流性卵和產沉性卵魚類中ZP2基因重復結構域的缺失影響了魚卵粘性的形成及卵膜硬化。鯉形目中，產漂流性卵魚類有50余種，本研究獲得了7種典型的代表性魚類，包括翹嘴鲌(鲌亞科Culterinae)、鳊(鲌亞科)、銀鲴(鲴亞科Xenocyprininae)、似鳊(鲴亞科)、銀(亞科Gobioninae)、光唇蛇(亞科)和犁頭鰍(平鰭鰍科Balitoridae)，約占產漂流性卵類群的14%，但產沉性卵和粘性卵的物種數較少，因此不同物種重復結構域的差異是否引起了ZP2蛋白空間結構的差異并導致了產卵習性的不同還需要進一步功能實驗的證實。

3.3 鯉形目魚類ZP2基因的選擇壓力

突變、遺傳變異、選擇和基因流是自然生物進化的主要動力(沈銀柱，黃占景，2012)。在選擇壓力檢驗中，非同義突變與同義突變的比值(ω=dN/dS)被用于衡量基因或者其中個別位點是否受到選擇壓力(Yang &Nielsen，1998)。不導致氨基酸改變的核苷酸變異被稱為同義突變，反之為非同義突變。一般認為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。在長期進化過程中，選擇壓力不可能均勻地作用于1個基因，根據其功能作用，它更有可能在某些特定位點發(fā)生(Kamath &Getz，2011)。在硬骨魚中，有關卵膜和精子相互作用的證據很少，ZP蛋白在精卵結合中可能沒有起到作用，因為精子只能通過珠孔進入卵子，卵膜中任何與精子結合的分子都會聚集在珠孔周圍，但是沒有跡象表明ZP蛋白在魚卵的珠孔周圍，魚類的ZP蛋白可能只起到了結構性作用，如保護功能(Conner &Huang，2003)。ZP蛋白家族通常包含大量的ZP基因(Xuetal.，2012)。ZP基因家族在硬骨魚類中產生了不同程度的擴張，如斑馬魚中可分離出21個ZP基因，有研究認為，斑馬魚ZP基因的大量擴張可能與其需要大量產卵有關(Conner &Hughes，2003)；雅羅魚Leuciscus waleckii基因組可鑒定出 30個ZP基因，ZP基因的擴張增強了雅羅魚在堿性環(huán)境中胚胎發(fā)育的保護能力，這些擴張均被正向選擇驅動(Xuetal.，2017；吳天利，2018)。此外，南極魚的ZP基因在寒冷條件下大量擴張，有助于豐富ZP蛋白的轉錄本和增加卵膜的厚度，從而被認為是防止冰滲透的關鍵物理屏障，使南極魚可以適應極端的低溫環(huán)境(Chenetal.，2008；馬戰(zhàn)領，2015)。但是，胎生月光魚Xiphophorus maculatus的ZP基因家族在正選擇下相對減少，因為這些ZP蛋白對胚胎的保護不再是必要因素，而是進化出了氣體和物質交換的機制(Schartletal.，2013)。

本研究基于位點模型分析，發(fā)現(xiàn)鯉形目魚類的ZP2基因中存在正選擇的氨基酸位點(ω>1)，表明ZP2基因在鯉形目魚類演化中同樣經歷了正向選擇，但ZP基因在鯉形目魚類中是否經歷擴張還需要對該類群進行更深層次的研究。

致謝：感謝中國科學院水生生物研究所張富鐵老師、陳林、秦強在野外采集的樣本，感謝張智和張曉宇在實驗上提供的幫助。