宋凱

高強(qiáng)度超聲波對(duì)溶菌酶抑菌活性的影響

宋凱

徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥品食品學(xué)院, 江蘇 徐州 221006

為探究應(yīng)用高強(qiáng)度超聲波處理后溶菌酶抑菌活性的改變，本文以蛋清溶菌酶為原料，超聲波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，間隔10 s）分別處理5、10、15、20、25、30、45以及60 min，對(duì)比超聲處理前后溶菌酶抑菌活性變化。結(jié)果表明：超聲處理后，蛋清溶菌酶對(duì)大腸桿菌JM109的抑菌活性顯著增強(qiáng)，而對(duì)金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌活性則明顯降低，因此，適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚頃?huì)增強(qiáng)溶菌酶對(duì)大腸桿菌的抑菌活性。

超聲波; 溶菌酶; 抑菌活性

溶菌酶（Lysozyme）別名球蛋白，同時(shí)被稱作胞壁質(zhì)酶。這是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的糖苷水解酶，廣泛存在于人體多種組織器官及血液、汗液等分泌物中，絕大多數(shù)商品溶菌酶是從蛋清中分離純化得到的。蛋清溶菌酶作為非廣譜抗菌劑，主要作用于革蘭氏陽性細(xì)菌，其主要成分肽聚糖能夠水解細(xì)胞壁，但在革蘭氏陰性菌內(nèi)含量較少，且覆有一層較厚脂多糖類物質(zhì)，因此對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌幾乎不產(chǎn)生抑制作用[1]。

超聲波，在適當(dāng)強(qiáng)度和頻率下，發(fā)揮特有的空化作用，形成振蕩反應(yīng)，破壞物質(zhì)之間相互引力的吸附作用[2]。嚴(yán)偉等[3]論述超聲波提取技術(shù)時(shí)同時(shí)提出高強(qiáng)度超聲波對(duì)酶有抑制作用；高紜芳[4]研究酪蛋白酶的蛋白結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)：隨著超聲強(qiáng)度的增強(qiáng)，其對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響就越大。在超聲強(qiáng)度為400 w時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)就會(huì)變得疏松多孔；吳瓊英等[5]將超聲未處理數(shù)據(jù)與超聲處理數(shù)據(jù)進(jìn)行比較：超聲波-離子液耦合預(yù)處理對(duì)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯破壞作用，其疏水基團(tuán)大量顯于蛋白表面。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溶菌酶（≥20000 U/mg），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

菌株：大腸桿菌JM109，金黃色葡萄球菌，溶壁微球菌，北京索萊寶科技有限公司。

酵母粉，宜興永信生物有限公司（江蘇）；蛋白胨，盛思生化科技有限公司（上海）；氯化鈉，氫氧化鈉，中泰化學(xué)試劑有限公司（上海）；瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，XB-20雪花制冰機(jī)，新芝生物科技股份有限公司（寧波）；KYC-100C恒溫?fù)u床，維誠儀器有限公司(上海)；普析儀器有限責(zé)任公司(北京)；DNP9162E電熱恒溫培養(yǎng)箱，精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司(上海)；SW-CJ-IF單人雙面超凈臺(tái)，安泰技術(shù)公司(蘇州)；MILLI-Q超純水儀；高壓蒸汽滅菌器，致微儀器有限公司(廈門)；AIRAJ游標(biāo)卡尺，易購五金工具有限公司(青島)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶菌酶超聲樣品預(yù)處理將0.2 mg蛋清溶菌酶溶于100 mL超純水中，置于冰浴中，取未經(jīng)超聲處理的樣品1 mL，設(shè)為對(duì)照組。同時(shí)在冰浴條件下，取已配置完成的溶菌酶25 mL于離心管中。分別在超聲波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，間隔10 s）條件下處理5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min，45 min，60 min，各取樣1 mL，并保存8組樣品數(shù)據(jù)[6-8]。

1.3.2 培養(yǎng)基配制酵母培養(yǎng)基，在高壓滅菌鍋(121 ℃，0.1 MPa)條件下滅菌20 min。液體培養(yǎng)基靜置冷卻待用；固體培養(yǎng)基內(nèi)加入瓊脂(1.5%)，在超凈工作臺(tái)中制作無菌平板(10 mL)若干，凝固待用。

1.3.3 菌懸液的制備在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)分別挑取少量的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌接種于提前制備好的培養(yǎng)皿中，恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）培養(yǎng)24 h。然后，用接種環(huán)分別挑取少量培養(yǎng)菌體，接種到液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床（37 ℃）培養(yǎng)12 h。取適量菌液根據(jù)十倍稀釋法稀釋，在一定濃度梯度下得到不同菌懸液。分別取稀釋度為10-6、10-7和10-8的菌液平板培養(yǎng)，37 ℃，24 h，計(jì)菌落數(shù)，然后用滅菌去離子水稀釋原菌懸液至106~107CFU/mL[9]。

1.2.4 抑菌圈的測(cè)定方法參考杯碟法[10]并略有修改。取20 mL熔化的固體培養(yǎng)基置于平板中，凝固后，取菌液濃度為106~107CFU/mL的三種菌懸液200 μL，分別均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，10 min后，待菌液基本干透，在每個(gè)培養(yǎng)皿表面均勻放置5片濾紙片，用移液槍分別加入9種樣品液，蓋好培養(yǎng)皿，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)抑菌圈直徑。樣品實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次，以計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲強(qiáng)度處理溶菌酶的抑菌圈直徑

根據(jù)1.2.4的方法測(cè)定未處理的蛋清溶菌酶與經(jīng)超聲波處理后改變抑菌性的溶菌酶對(duì)3種菌的抑菌圈直徑的影響。每個(gè)樣品液重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)其抑菌圈直徑，結(jié)果見表1~3。

表 1 溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑

從上表1可知，未經(jīng)過超聲處理的溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，平均抑菌圈6.20 mm。且溶菌酶抑菌圈總體呈下降趨勢(shì)，由此可見隨著超聲處理溶菌酶時(shí)間的延長，溶菌酶抑菌活性先增強(qiáng)后下降，具體情況詳見圖1。

表 2 溶菌酶對(duì)大腸桿菌JM109的抑菌圈直徑

從上表2可知，未經(jīng)過超聲處理的溶菌酶對(duì)大腸桿菌JM109無抑菌活性，平均抑菌圈6.00 mm。而溶菌酶抑菌圈總體呈上升-持平-下降趨勢(shì)，由此可見隨著超聲處理溶菌酶時(shí)間的延長，溶菌酶抑菌活性先增強(qiáng)后減弱，且在10 min出現(xiàn)最大值，具體情況詳見圖2。

表 3 溶菌酶對(duì)溶壁微球菌的抑菌圈直徑

從上表3可知，未經(jīng)過超聲處理的溶菌酶對(duì)溶壁微球菌有明顯抑菌活性，平均抑菌圈6.30 mm。而溶菌酶抑菌圈總體呈下降趨勢(shì)，由此可見隨著超聲處理溶菌酶時(shí)間的延長，溶菌酶抑菌活性整體逐漸下降，具體情況詳見下圖3。

2.2 不同超聲強(qiáng)度處理溶菌酶抑菌曲線變化

根據(jù)表1-3數(shù)據(jù)所示平均值，作折線圖，如下

圖 1 不同超聲強(qiáng)度處理溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌活性的影響

圖 2 不同超聲強(qiáng)度處理溶菌酶對(duì)大腸桿菌JM109活性的影響

圖 3 不同超聲強(qiáng)度處理溶菌酶對(duì)溶壁微球菌活性的影響

根據(jù)圖1~圖3，在超聲時(shí)間為0 min時(shí)，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌、溶壁微球菌均有抑菌活性，且對(duì)溶壁微球菌抑菌活性最高，而對(duì)大腸桿菌JM109基本無明顯抑菌活性。在超聲時(shí)間為5 min時(shí)，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都有所增強(qiáng)，但三種菌抑菌活性的數(shù)值略有不同，金黃色葡萄球菌增強(qiáng)的數(shù)值最大，為0.34 mm。在超聲時(shí)間為60 min時(shí)，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都逐漸消失。

綜上所述，經(jīng)過超聲波處理后，溶菌酶對(duì)大腸桿菌JM109的抑菌活性有顯著增強(qiáng)，而對(duì)金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌的抑菌活性則明顯降低。

3 討論

在超聲處理時(shí)間為5 min時(shí)，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌JM109和溶壁微球菌的抑菌活性都有上升，而隨著超聲波處理時(shí)間延長，抑菌活性呈下降趨勢(shì)。處理時(shí)間60 min時(shí)，溶菌酶對(duì)三種菌的抑菌活性消失。導(dǎo)致溶菌酶抑菌活性變化的原因可能是超聲波會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。隨著超聲處理時(shí)間的延長，溶菌酶的蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)開始發(fā)生改變，蛋白表面疏水性氨基酸殘基增加，溶菌酶對(duì)革蘭氏陰性菌的穿透性增強(qiáng)。隨著超聲處理時(shí)間的延長，蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸被打亂，活性中心收到破壞，抑菌活性消失。

陶樹興等[11]研究了超聲波處理與溶菌酶單獨(dú)處理對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制作用的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能增強(qiáng)溶菌酶的抑菌活性。羅彩林等[12]對(duì)比超聲波處理溶菌酶和未經(jīng)超聲處理溶菌酶的活性以及西施舌活性物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲波為150 w，15 min時(shí)，超聲波處理未破壞溶菌酶活性。前者與我們的實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果，后者與我們的結(jié)論形成對(duì)比，相同超聲時(shí)間下，超聲波強(qiáng)度較低時(shí)對(duì)溶菌酶活性沒有影響，而高強(qiáng)度超聲波對(duì)溶菌酶抑菌活性有影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)超聲強(qiáng)度和超聲時(shí)間這些相關(guān)參數(shù)的改變，某種程度上會(huì)引起溶菌酶抑菌活性的改變。

4 結(jié)論

一定強(qiáng)度的超聲波（650 w，振幅30%，20 kHz，工作10 s，間隔10 s）處理可以有效增強(qiáng)溶菌酶對(duì)三種菌株的抑菌活性，其中金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌的最佳處理時(shí)間為5 min，而大腸桿菌JM109的最佳處理時(shí)間為10 min。在超聲波處理時(shí)間為10 min時(shí)，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性沒有下降。因此，適量的超聲波處理可拓寬溶菌酶的抑菌圖譜。

[1] 趙電波,白艷紅,張小燕,等.天然生物防腐劑溶菌酶的改性研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2010,18(5):200-2004

[2] 楊曼利.雞蛋清中溶菌酶的提取及改性研究[D].南京:江南大學(xué),2014

[3] 應(yīng)崇福.超聲學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1990:513

[4] 高紜芳.超聲波處理對(duì)酪蛋白酶特性的影響[D].鄭州:河南工業(yè)大學(xué),2013

[5] 吳瓊英,賈俊強(qiáng),杜金娟,等.超聲波-離子液體耦合預(yù)處理制備蠶蛹蛋白質(zhì)ACE抑制肽的工藝優(yōu)化[J].食品與生物技 術(shù)學(xué)報(bào),2014,33(6):633-640

[6] 羅昭鋒,瞿鑫,沐萬孟,等.超聲和高壓處理對(duì)牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J].中國生物工程雜志,2006,26(1):46-49

[7] 吳序櫟,朱倩倩,成小娟,等.光譜法研究雞蛋溶菌酶熱變性與免疫原性的關(guān)系[J].分析化學(xué),2011,39(2):198-202

[8] 方盈盈,胡新根,于麗,等.溶菌酶熱變性的DSC研究[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(1):84-87

[9] 楊曼利,曹棟,史蘇佳.化學(xué)法改性溶菌酶抑菌性及其結(jié)構(gòu)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(6):22-26

[10] 吳迪,蔡偉民.殼聚糖對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的影響[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),2003,20(3):101-104,108

[11] 陶樹興,王婷婷,梁健,等.超聲和溶菌酶對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌的協(xié)同殺菌作用[C]//中國微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文 摘要集.?？?中國微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì),2008:335

[12] 羅彩林,溫?fù)P敏,鄭晨娜.超聲波法提取西施舌活性物質(zhì)及溶菌酶(LSZ)活性的比較[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2011,24(4):469-472

Effect of High Intensity Ultrasound on Antibacterial Activity of Lysozyme

SONG Kai

221006,

To investigate the change of antibacterial activity of Lysozyme after high intensity ultrasonic treatment, this paper used egg white Lysozyme as raw material, ultrasonic treatment (650 w, amplitude 30%, 20 kHz, working 10 s, interval 10 s) was conducted for 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 and 60 min, respectively. Results showed after ultrasound treatment, the antibacterial activity of egg white Lysozyme againstJM109 was significantly enhanced, while the antibacterial activity of egg white Lysozyme againstandwas significantly decreased. Therefore, proper ultrasonic treatment can enhance the antibacterial activity of Lysozyme against.

Ultrasound; Lysozyme; antibacterial activity

Q814.9

A

1000-2324(2021)02-0266-04

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.019

2020-02-05

2020-03-21

徐州市科技計(jì)劃項(xiàng)目:人溶菌酶重組改性及抑菌活性研究(KC16SG274)

宋凱(1977-),男,碩士,副教授,主要從事生物工程專業(yè)教學(xué)與研究工作. E-mail:13505211235@139.com