李佳俊，陶麗紅，葉 敏，王凱博,，吳文偉，何成興，范黎明，蘇發(fā)武

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明 650201；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205）

0 引言

灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是主要的植物病原真菌之一，其寄主廣泛，能夠引起多種蔬菜、果樹、花卉等作物的灰霉病[1]?；颐共∥：乐?，且易于傳播，若未及時防治常會造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。在現(xiàn)階段的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式中，灰霉病的防治仍依賴化學(xué)農(nóng)藥的使用[3]，生物防治等措施因其自身的局限性，尚未大范圍應(yīng)用[4]。在生產(chǎn)中，防治灰霉病的常用藥劑根據(jù)作用方式可分為保護性殺菌劑和內(nèi)吸性殺菌劑。啶酰菌胺(boscalid)是防治灰霉病最為常用的內(nèi)吸性殺菌劑，屬于煙酰胺類化合物，其作用機制獨特，能夠抑制植物病原真菌線粒體的琥珀酸脫氫酶，阻斷三羧酸循環(huán)，從而抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)[5]。啶酰菌胺具有高效、低毒的特點，對番茄、黃瓜、草莓等多種作物灰霉病防效顯著[6-8]。但與多數(shù)內(nèi)吸性殺菌劑相同，其作用位點單一，屬于高抗性風險的殺菌劑[9]。目前，B.cinerea對包含啶酰菌胺在內(nèi)的多種內(nèi)吸性殺菌劑已處于較高抗性風險水平，亟需尋找合理的方案來延緩抗藥性的蔓延[10]。另外，啶酰菌胺等琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑(SDHIs)對魚類具有毒性，其大量使用存在環(huán)境污染風險[11-13]。百菌清(chlorothalonil)是灰霉病防治中最為常用的保護性殺菌劑之一。保護性殺菌劑不易產(chǎn)生抗藥性，但抑菌活性低于內(nèi)吸性殺菌劑[14]，需進一步提高其抑菌活性。

混劑的開發(fā)和利用是延緩抗藥性發(fā)生的重要手段，合理搭配的混劑不僅能夠提高抑菌活性，降低農(nóng)藥使用量和防治成本，且能夠延緩抗藥性的發(fā)生。植物在長期進化過程中，為抵抗病原菌的侵入，產(chǎn)生了很多具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝產(chǎn)物是篩選殺菌劑抑菌活性成分的寶庫，天然殺菌劑活性成分篩選在新型殺菌劑的研發(fā)中占有重要地位[15]。但是，大多數(shù)次生代謝產(chǎn)物的抑菌活性低于化學(xué)合成的殺菌劑，難以將其直接用于植物病害防治。除直接利用外，與化學(xué)合成殺菌劑混配使用也是從天然產(chǎn)物研發(fā)新農(nóng)藥的途徑之一。作者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)：天然單萜酚類化合物與噻呋酰胺和苯醚甲環(huán)唑之間具有明顯的協(xié)同增效作用，部分混劑配方對立枯絲核菌的抑菌活性優(yōu)于化學(xué)合成殺菌劑噻呋酰胺和苯醚甲環(huán)唑[16]。將作用機制獨特的天然抑菌活性成分與化學(xué)合成殺菌劑混配，不僅有望獲得高活性的抑菌組合物，而且能夠降低化學(xué)農(nóng)藥使用量，是開發(fā)新型殺菌劑混劑的合理策略。

本課題組在篩選天然抑菌活性成分的過程中發(fā)現(xiàn)：天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚對B.cinerea具有一定的抑制活性，但低于化學(xué)合成殺菌劑百菌清和啶酰菌胺[17]。因此，本研究將百里香酚、和厚樸酚分別與啶酰菌胺、百菌清以不同比例混配，通過菌絲生長速率法測定混劑對B.cinerea的抑菌活性，并使用Bliss法、Mansour法、孫云沛法評價其聯(lián)合作用。該研究結(jié)果能夠為研究天然酚類化合物與殺菌劑混配奠定基礎(chǔ)，同時能夠為天然抑菌活性成分的利用和殺菌劑混劑研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

本研究所用Botrytiscinerea病原菌采集于云南省玉溪市通?？h玫瑰灰霉病病葉。分離純化后經(jīng)ITS測序鑒定確認，4℃條件下保存于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南生物資源保護與利用國家重點實驗室。保藏菌株經(jīng)活化后用于抑菌活性測定。實驗于2019年10月—2020年6月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所進行。

1.2 供試化合物

百里香酚(CAS:89-83-8，99%)購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；和厚樸酚(CAS:35354-74-6，98%)購買于安耐吉薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；百菌清(97%)、啶酰菌胺(97%)由廣西田園生化股份有限公司提供；二甲基亞砜(AR)購于廣州賽國生物科技有限公司。

1.3 抑菌活性測定

采用菌絲生長速率法測定百里香酚、和厚樸酚、百菌清、啶酰菌胺及其混劑對B.cinerea的抑菌活性，方法如下：將百里香酚、和厚樸酚、百菌清、啶酰菌胺用二甲基亞砜配制成等比濃度梯度的母液，分別將百里香酚、和厚樸酚和百菌清、啶酰菌胺以10:1、5:1、3:2、2:3、1:5、1:10的比例混配。將待測藥加入約45℃的PDA培養(yǎng)基中混勻后，倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中制成帶藥平板，加入等量的二甲基亞砜作為對照。用內(nèi)徑為5 mm的打孔器打取培養(yǎng)3天的B.cinerea菌餅置于平板中央，于25±1℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。待對照組菌落長至接近培養(yǎng)皿邊緣時以十字交叉法測量菌落直徑，用公式(1)計算抑菌率。

1.4 混劑的增效作用測定及篩選

結(jié)合 Bliss法[18]、Mansour法[19]和孫云沛法[20]并加以優(yōu)化，初步評價天然酚類化合物與百菌清、啶酰菌胺混配是否具有增效作用。流程如下：

（1）分別測定百里香酚、和厚樸酚、百菌清、啶酰菌胺在不同濃度下對B.cinerea的抑菌活性，并計算其EC50值。

（2）根據(jù)公式(2)[20]，估算混劑的理論EC50值。

其中EC50A：組分A的EC50；RA：組分A在混劑中的比例；EC50B：組分B的EC50；RB：組分B在混劑中的比例。

（3）根據(jù)混劑的理論EC50值選擇相近濃度(ρ50)，通過公式(3)～(4)計算單劑的理論濃度ρA和ρB，根據(jù)單劑的毒力回歸曲線計算單劑的理論抑制率，并通過公式(5)計算混劑的理論抑菌率[18]。

其中PA：濃度為ρA時組分A的理論抑菌率；PB：濃度為ρB時組分B的理論抑菌率；Mt：混劑的理論抑菌率；RA：組分A在混劑中的比例；RB：組分B在混劑中的比例。

（4）測定混劑在ρ50濃度下的抑菌率，并通過公式(6)計算增效指數(shù)[19]。

其中Mt：混劑的理論抑菌率；Me：實測抑菌率。

增效指數(shù)＜-20為拮抗作用，-20≤增效指數(shù)≤20為相加作用，增效指數(shù)＞20為協(xié)同增效作用。

1.5 混劑聯(lián)合毒力測定

采用孫云沛法[20]，計算具有增效作用的混劑配方中單劑之間的共毒系數(shù)，定量分析其聯(lián)合毒力。具體計算方法如式(7)～(10)。

其中CTC＜80為拮抗作用，80≤CTC≤120為相加作用，120＜CTC為協(xié)同增效作用。

1.6 數(shù)據(jù)分析

化合物和混劑的抑菌率、增效指數(shù)、共毒系數(shù)使用Excel軟件計算，毒力回歸方程和EC50值使用SPSS 22.0軟件中的Probit模型進行回歸、分析、計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然酚類化合物與百菌清、啶酰菌胺混配的增效作用

百里香酚與百菌清、啶酰菌胺混配增效作用的定性分析結(jié)果如表1所示。根據(jù)結(jié)果可知，百里香酚和百菌清以5:1、1:5和1:10比例混配時顯示為增效作用，其中兩者以1:5的比例混配時增效指數(shù)最高，為55.24，高于其他配比。百里香酚與百菌清在10:1、3:2、2:3的配比下混配時均為相加作用。百里香酚與啶酰菌胺在本次實驗所選的6個配比組合下未篩選出具有協(xié)同增效的組合，均為相加作用。

表1 百里香酚與百菌清及啶酰菌胺混配的增效指數(shù)

和厚樸酚與百菌清、啶酰菌胺混配增效作用的定性分析結(jié)果如表2所示。和厚樸酚與百菌清混配在本次實驗所設(shè)置的6個配比下顯示為增效作用或相加作用，未見有拮抗作用的組合。和厚樸酚與百菌清在3:2、2:3的配比下為增效作用，以2:3的比例混配時增效效果最好，增效指數(shù)為55.12。和厚樸酚與啶酰菌胺混配在6個配比組合下均顯示出相加作用。

表2 和厚樸酚與百菌清及啶酰菌胺混配的增效指數(shù)

由表1、表2可知，百里香酚、和厚樸酚與百菌清混配均篩選出了具有增效作用的配比。其中百里香酚與百菌清以1:5比例混配、和厚樸酚與百菌清以2:3比例混配時增效作用為組中最高，增效指數(shù)分別為55.24、55.12。百里香酚、和厚樸酚與啶酰菌胺混配時均無增效的組合。初篩中百里香酚、和厚樸酚與百菌清混配均表現(xiàn)出增效作用或相加作用，為進一步測定其聯(lián)合毒力，本研究采用孫云沛法測定其共毒系數(shù)，定量分析其增效效果。

2.2 增效配方的聯(lián)合毒力

百里香酚與百菌清及其混配的聯(lián)合毒力測定結(jié)果如表3所示。由表3可知，百菌清對B.cinerea的EC50為0.65 mg/L，當百里香酚與百菌清混用之后，2:3、1:5、1:10比例下其EC50均低于0.65 mg/L，其對B.cinerea的抑菌活性得到了提高，1:10時EC50最低，為0.30 mg/L。百里香酚與百菌清以5:1、2:3、1:5、1:10的比例混配時其共毒系數(shù)大于120，均表現(xiàn)為協(xié)同增效作用，其中以1:5的比例混配時時協(xié)同增效作用最強，共毒系數(shù)為249.03，其次是1:10，共毒系數(shù)為237.49。百里香酚和百菌清在10:1和3:2時表現(xiàn)為相加作用。

表3 百里香酚、百菌清及其混配對B.cinerea的毒力及共毒系數(shù)

和厚樸酚與百菌清及其混配的聯(lián)合毒力測定結(jié)果如表4所示。由表可知，和厚樸酚與百菌清以3:2、2:3、1:10的比例混配后EC50均低于百菌清單獨使用時的EC50(0.65 mg/L)，對B.cinerea的抑菌活性得到了提高，其中以1:10混配EC50最低，為0.29 mg/L。和厚樸酚與百菌清以1:5的比例混配時共毒系數(shù)為119.25，表現(xiàn)為相加作用，其他5個配比的共毒系數(shù)值均大于120，為協(xié)同增效。和厚樸酚與百菌清以10:1的比例混配時增效效果最好，其共毒系數(shù)為309.15。

表4 和厚樸酚、百菌清及其混配對B.cinerea的毒力及共毒系數(shù)

2.3 混劑和單劑在不同濃度下的抑菌活性對比

百里香酚與百菌清以1:5的比例混配時的共毒系數(shù)較其他比例混配時高，為249.03；兩者以1:10混配時抑菌活性最高，EC50為0.30 mg/L。和厚樸酚與百菌清以10:1混配時共毒系數(shù)為309.15，高于其他比例；兩者以1:10混配時抑菌活性最高，EC50為0.29 mg/L。為探討這些混劑用于灰霉病防治的潛力，本研究對比了兩種酚類化合物與百菌清混配后增效作用最明顯和抑菌活性最高的混劑與百菌清單劑在一定濃度下的抑菌活性，結(jié)果如圖1、2所示。

圖1 百里香酚與百菌清混配的抑菌活性

圖2 和厚樸酚與百菌清混配的抑菌活性

結(jié)果表明：百里香酚與百菌清以1:5和1:10比例混配時，在0.125～8 mg/L濃度下的抑菌活性均高于百菌清。如：百菌清在8 mg/L濃度下對B.cinerea的抑菌率為87.55%，而百里香酚與百菌清以1:5和1:10比例混用后在2～8 mg/L濃度下的抑菌率均為100%。和厚樸酚與百菌清以1:10比例混配時抑菌活性最高，2～8 mg/L濃度下的抑菌率均為100%，在0.5～8 mg/L濃度下的抑菌活性均高于百菌清；以10:1比例混配時共毒系數(shù)最高，二者之間表現(xiàn)出很強的協(xié)同增效作用，但混劑在0.5～8 mg/L濃度下的抑菌活性均低于百菌清單劑。該結(jié)果是由于和厚樸酚的抑菌活性遠低于百菌清所致。綜合抑菌活性測定結(jié)果可知，將百里香酚、和厚樸酚與百菌清合理混配不僅能達到更好的殺菌效果，還能降低化學(xué)農(nóng)藥百菌清的使用量，具備用于灰霉病防治的潛力。

3 討論

目前，防治灰霉病混劑的研發(fā)以化學(xué)農(nóng)藥之間的混配為主。趙建江等[21-22]測定了啶酰菌胺分別與唑胺菌酯、嘧菌酯混配對灰葡萄孢菌的增效作用，結(jié)果表明啶酰菌胺與唑胺菌酯在9個質(zhì)量比下混配對灰葡萄孢菌均表現(xiàn)為增效作用，1:3時增效明顯，增效系數(shù)為4.76；啶酰菌胺與嘧菌酯以質(zhì)量比7:1、5:1、3:1、1:1、1:5、1:3和1:7比例混配均表現(xiàn)增效作用，其中以1:1混配增效系數(shù)高達4.5。劉妤玲等[23]測定了吡唑醚菌酯和氟菌唑?qū)Ψ鸦颐共〉穆?lián)合毒力，結(jié)果表明吡唑醚菌酯和氟菌唑以質(zhì)量比2:1、1:1混配具有增效作用。與上述的化學(xué)合成殺菌劑間二元混配不同，本研究將天然酚類化合物與化學(xué)合成殺菌劑混配，發(fā)現(xiàn)百里香酚、和厚樸酚分別與百菌清混配不僅能夠提高抑菌活性，而且能減少化學(xué)農(nóng)藥使用量。另外，不同作用機理的殺菌劑間的混配能夠降低抗性風險、延緩灰葡萄孢菌抗藥性的產(chǎn)生，可以作為開發(fā)灰霉病防治藥劑的優(yōu)選方案。

評價農(nóng)藥混用的聯(lián)合毒力常用的方法有三角坐標法、Bliss法、Mansour法、孫云沛法、πonob法和Finney法[24]。其中，三角坐標法、Bliss法、Mansour法是基于單劑在單一濃度下的毒力估算期望毒力的分析方法，常用于混劑增效作用的定性分析。而孫云沛法、πonob法和和Finney法是基于藥劑的EC50或LD50來評價混劑的聯(lián)合作用，常用于混劑增效作用的定量分析。在實際篩選工作中，往往需要將兩類方法結(jié)合，兼顧篩選效率和預(yù)估增效作用的準確率[25]。目前，孫云沛法是國內(nèi)最為常用的聯(lián)合毒力測定和評價方法，但定性分析方法卻無統(tǒng)一標準。雖然Bliss法、Mansour法均為基于單劑在單一濃度下毒力估算期望毒力的分析方法，但期望死亡率（抑菌率）的計算方法不同，Bliss法中，單劑混用后的理論毒力Mt=1-(1-PA)(1-PB)，即為Mt=PA＋PB-PA×PB[18]；而 Mansour法中，單劑混用后的理論死亡率Mt=PA＋PB[19]。在農(nóng)藥室內(nèi)毒力測定實驗中，一個靶標生物無法同時被兩種藥物殺死兩次，因此Mansour法中混劑毒力期望值為單劑毒力相加是不合理的。但是，Bliss法中判斷混劑增效效果為實際毒力(Me)-理論毒力(Mt)，而Mansour法判斷混劑增效效果為增效指數(shù)（協(xié)同毒力指數(shù)）=(Me-Mt)/Mt×100，能夠更準確的反應(yīng)混劑實際毒力和理論毒力的差異。另外，使用孫云沛法定量分析混劑的增效作用、估算藥劑之間的聯(lián)合毒力時，共毒系數(shù)的計算是基于藥劑理論和實測的EC50或LD50。將兩種方法結(jié)合定性分析混劑的增效作用時，應(yīng)參考定量分析方法估算的混劑濃度（即為接近混劑理論毒力EC50或LD50時的濃度）來確定混劑的理論毒力。因此，本文最終使用的混劑增效作用的定性分析方法為1.4中所述方法，定量分析方法為孫云沛法。

根據(jù)3.1和3.2中結(jié)果可知：選用本研究所述方案進行混劑增效作用的定性分析和定量分析，其結(jié)果趨勢一致。定性分析時表現(xiàn)出協(xié)同增效或相加作用的混劑配方在定量分析時結(jié)果均為有一定的協(xié)同增效或相加作用。另外，以不同比例混配時增效作用高低趨勢相同，如：百里香酚與百菌清1:5比例混配時增效指數(shù)為55.24，在所測配比中增效作用最強，在計算共毒系數(shù)時該配比的共毒系數(shù)(249.03)也是最高的；以10:1和3:2比例混配時增效指數(shù)較低，在定量分析時其CTC值也較其他配比低。和厚樸酚和百菌清以1:5比例混配時增效指數(shù)為3.10，為相加作用，定量分析時共毒系數(shù)為119.25，亦為相加作用。因此，合理選擇混劑增效作用的定性分析方法與定量分析方法并結(jié)合使用，能夠有效降低篩選工作量，且準確率較高，是混劑篩選的合理方案。

另外，僅以孫云沛法評價混劑的增效作用具有一定的不合理性，篩選結(jié)果在劑量和成本方面與實際生產(chǎn)應(yīng)用存在差異[26]。本文中和厚樸酚和百菌清以10:1比例混配的實測EC50值為1.87 mg/L，CTC值為309.15，表現(xiàn)出很強的協(xié)同增效作用，但混劑在0.5～8 mg/L濃度下的抑菌活性均低于百菌清。這是由于和厚樸酚對B.cinerea的EC50值(27.38 mg/L)遠高于百菌清的EC50值(0.65 mg/L)，和厚樸酚與百菌清以10:1比例混配時，其理論EC50值為5.78 mg/L，高于百菌清的EC50(0.65 mg/L)。雖然該配方表現(xiàn)出較高的協(xié)同增效作用，但由于抑菌活性低于殺菌劑百菌清，所以不能作為和厚樸酚和百菌清混配使用時的最優(yōu)配方。在殺菌劑混劑的篩選中，不僅需要考慮各成分之間的共毒系數(shù)，還需綜合考慮混劑的抑菌效果，平衡成本、活性與共毒系數(shù)之間的關(guān)系，選擇最佳的配比。本研究所得結(jié)果對篩選、開發(fā)防治灰霉病的混劑具有指導(dǎo)意義，但篩選殺菌劑混劑的過程中所采用的抑菌活性測定方法為菌絲生長速率法，在未來研究中，需將混劑開發(fā)成劑型，結(jié)合盆栽試驗和田間試驗數(shù)據(jù)進一步分析天然酚類化合物與殺菌劑百菌清混配的最優(yōu)配比。

4 結(jié)論

本研究將天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚與化學(xué)殺菌劑百菌清、啶酰菌胺進行混配，篩選出了具有增效的配方：百里香酚和百菌清以5:1、2:3、1:5和1:10混配，和厚樸酚和百菌清以10:1、5:1、3:2、2:3和1:10比例混配均表現(xiàn)出了一定的增效作用。其中和厚樸酚和百菌清以10:1比例混配時協(xié)同增效作用最明顯，其CTC值為309.15，但其抑菌活性低于殺菌劑百菌清；以1:10比例混配時抑菌活性最高，其對B.cinerea的EC50為0.29 mg/L，高于百菌清單劑。天然酚類化合物百里香酚、和厚樸酚與百菌清以合理比例混配具有防治灰霉病的潛力，本研究能為開發(fā)防治灰霉病的藥劑提供理論支持。

同時，本研究優(yōu)化了混劑篩選方案：將Bliss法、Mansour法和孫云沛法3種農(nóng)藥混劑增效作用的評價方法結(jié)合，先進行配方的定性分析，初步篩選具有增效作用的配方，再進行定量分析，能夠以更高的效率篩選具有增效作用的配方，對混劑篩選方法的優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)意義。