富波年，馬樂元，馬慧霞，何仁元，楊曉燕

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

種子萌發(fā)及幼苗建成是植物生命周期的關(guān)鍵時期。種子在貯藏過程中，會受自身或外界環(huán)境的影響而發(fā)生劣變，從而導(dǎo)致種子萌發(fā)及幼苗生長能力下降，甚至死亡[1]。種子引發(fā)是通過控制種子吸水速率和吸水量，并逐步回干使其處于預(yù)發(fā)芽代謝狀態(tài)的一項技術(shù)[2]。有研究表明，引發(fā)處理使種子達到胚根即將突破種皮時的早期萌發(fā)狀態(tài)，可提高種子活力，促進種子萌發(fā)和幼芽生長[3-5]。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一種高分子滲壓劑，其本身不能滲入種子細胞中。用PEG浸種處理可使種子處于低水勢的介質(zhì)中，從而降低種子萌發(fā)過程中水分進入的速度，提高種子的出苗率及整齊度，縮短出苗期[6]，尤其對于不易萌發(fā)的種子(硬實度高、未成熟及老化種子)的促進效果顯著[7-8]。

小冠花(Coronillavaria)為豆科多年生草本植物，是優(yōu)良的飼用、水土保持、公路護坡、觀賞及綠肥植物，主要種植在我國西北干旱區(qū)域[9-10]。其種子硬實率高，發(fā)芽率低，發(fā)芽時間長，出苗率低且參差不齊[11-12]，已成為限制小冠花推廣種植的主要因素[13]。目前PEG引發(fā)處理提高種子活力，促進種子萌發(fā)和幼芽生長已在小麥[14]、燕麥[7]、穿心蓮[15]以及油菜[16]等多種植物種子的研究中得到證實。本研究用不同濃度PEG引發(fā)處理小冠花種子，從種子萌發(fā)、幼芽生長，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性等角度，研究PEG引發(fā)處理對小冠花種子萌發(fā)及幼芽生長的影響，為PEG引發(fā)技術(shù)在小冠花栽培種植上提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為種子引發(fā)技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供實踐依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試小冠花品種為綠寶石(LBS)和西輻(CY)，由甘肅創(chuàng)綠草業(yè)科技有限公司提供。本試驗在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院旱區(qū)生態(tài)研究所進行。

1.2 試驗設(shè)計

(1)供試小冠花種子，先用10%NaClO消毒10 min，用蒸餾水沖洗數(shù)次，再用吸水紙吸干待用[17]。在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，共設(shè)10個處理，每個處理6個重復(fù)。以沒有處理的原始種子作為對照(CK)，將小冠花種子分別置于0%(蒸餾水)和10%、20%、30%的PEG溶液中，種子重量與溶液體積比為1∶5 [(W(g)∶V(mL)],在25℃的發(fā)芽箱內(nèi)培養(yǎng)12 h,用蒸餾水將種子上的PEG溶液洗凈、濾紙吸干，攤在發(fā)芽紙上移入25℃的鼓風(fēng)干燥箱，回干至原種子質(zhì)量，密封于常溫下待用。

表1 實驗處理方案

(2)采用培養(yǎng)皿濾紙法進行種子萌發(fā)實驗。挑選兩個品種飽滿、大小一致的引發(fā)和對照(CK)處理小冠花種子，置于底部墊有兩層發(fā)芽紙的標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿放入60粒種子，加入10 mL蒸餾水，加蓋，置于種子發(fā)芽箱，8 h光照、16 h黑暗，光子量照度300 μmol/(m2·s)，溫度為25℃，相對濕度為70%，進行發(fā)芽試驗[18]。每2 d定量補加蒸餾水，使其保持濕潤。每天統(tǒng)計發(fā)芽率，共統(tǒng)計10 d(根據(jù)預(yù)實驗此時種子已經(jīng)停止萌發(fā))，并測定種子萌發(fā)指標(biāo)。選引發(fā)處理后萌發(fā)效果最佳的處理(10%PEG引發(fā))測定幼芽生理指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)和幼苗生長指標(biāo) 種子萌發(fā)以胚根0.2 cm作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，處理第4 d統(tǒng)計發(fā)芽勢(GE)，第9 d統(tǒng)計發(fā)芽率(GP),并計算發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI)。其中：發(fā)芽率(GP)=9 d發(fā)芽種子數(shù)/測試種子總數(shù)×100%，發(fā)芽勢(GE)=前4 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100%，發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，活力指數(shù)(VI)=GI×S[19](Gt為第t天的發(fā)芽數(shù),Dt為相應(yīng)發(fā)芽的天數(shù)，S為第9 d幼芽鮮重)。萌發(fā)9 d時，測量幼芽的生長指標(biāo)，每處理隨機抽取20株幼芽，用精度0.01 mm的游標(biāo)卡尺測量胚根尖到子葉端的長度。

1.3.2 幼芽生理指標(biāo)測定 取發(fā)芽試驗第10 d的CK處理和用10%PEG處理的幼芽進行生理指標(biāo)測定。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定：可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250比色法測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定[20]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[21]。

電解質(zhì)滲透率(電導(dǎo)率)用DDS-11A型電導(dǎo)儀測定幼芽外滲液電導(dǎo)率值[22]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[22]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素法進行差異顯著性分析,使用最小顯著差異法(least significant difference,LSD)在0.05顯著性水平進行差異顯著性分析，利用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG引發(fā)對小冠花種子萌發(fā)的影響

PEG處理下2個小冠花品種的種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)較CK顯著增高(圖1～3)，隨著PEG濃度的增加，兩個品種的各萌發(fā)指標(biāo)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中10%PEG處理效果最佳。10%PEG處理下，綠寶石(LBS)和西輻(CY)小冠花的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別比CK高550.06%、29.31%、74.54%和229.52%、25.42%、50.23%，且差異顯著(P<0.05)。30%PEG處理下，綠寶石(LBS)和西輻(CY)小冠花種子發(fā)芽勢較10%PEG處理顯著降低了55.03%和25.51%(P<0.05)，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)有所降低但未達到差異顯著水平。PEG處理下，綠寶石(LBS)小冠花種子活力指數(shù)較CK顯著提高了88.09%、75.07%和95.38%(圖4)，西輻(CY)小冠花種子活力指數(shù)也有提高但差異不顯著(P<0.05)。

圖1 PEG處理下小冠花種子的發(fā)芽勢Fig.1 Effects of PEG treatments on the germination vigour of Coronilla varia注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

圖2 PEG處理下小冠花種子的發(fā)芽率Fig.2 Effects of PEG treatments on the germination percentage of Coronilla varia

圖3 PEG處理下小冠花種子的發(fā)芽指數(shù)Fig.3 Effects of PEG treatments on the germination index of Coronilla varia

圖4 PEG處理下小冠花種子活力指數(shù)Fig.4 Effects of PEG treatments on the vitality index of Coronilla varia

2.2 PEG引發(fā)對小冠花幼芽生長的影響

不同濃度PEG處理，小冠花幼芽的生長指標(biāo)與對照相比呈先增加后降低的趨勢(圖5～7)。0%和10%PEG引發(fā)處理下，綠寶石(LBS)胚根長比CK增加18.45%、2.77%。胚芽長比CK增加20.30%、11.87%，但兩個品種與CK均未達到顯著水平。30%PEG引發(fā)處理時，與CK相比，綠寶石(LBS)和西輻(CY)胚根長分別降低32.19%、40.73%，胚芽長降低22.66%、22.96%，差異達到顯著水平(P<0.05)。隨PEG引發(fā)濃度增加，2個品種小冠花幼芽鮮重先增加后降低，10%PEG引發(fā)處理高于其他處理，其中西輻(CY)幼芽鮮重達到36.80 mg，顯著高于對照26.80 mg(P<0.05)。說明低濃度PEG處理對促進小冠花幼芽生長有積極作用，且品種間有差異。

圖5 PEG處理下小冠花幼苗的胚根長，胚芽長和鮮重Fig.5 Effects of PEG treatments on the hypocotyl length,epicotyl length and seedling fresh weight of Coronilla varia

2.3 PEG引發(fā)對小冠花幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和電解質(zhì)滲透率的影響

可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸是植物體內(nèi)參與滲透調(diào)節(jié)的主要有機溶質(zhì)。10% PEG處理后，綠寶石(LBS)和西輻(CY)幼芽可溶性蛋白含量較CK增加了137%和226%；脯氨酸含量高于CK 82.92 μg/g FW和82.04 μg/g FW，且均達到顯著水平(P<0.05)；可溶性糖含量有所增加，但差異不顯著。電解質(zhì)滲透率均顯著降低(P<0.05)，其中綠寶石(LBS)降低5.03%，西輻(CY)降低10.59%(表2)。說明適宜濃度PEG引發(fā)處理提升了幼芽滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低了細胞膜電解質(zhì)滲透率。2個品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和電解質(zhì)滲透率有差異，說明引發(fā)效果品種間存在差異。

表2 10%PEG引發(fā)處理下小冠花幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和電解質(zhì)滲透率

2.4 PEG引發(fā)對小冠花幼苗CAT、POD和SOD活性的影響

與CK相比，10% PEG處理下2個品種幼苗CAT、POD和SOD活性均顯著增加(表3)。PEG處理的綠寶石(LBS)和西輻(CY)幼苗CAT活性較CK分別增加了97.48%、39.82%；POD酶活性分別增加了71.69%、97.86%；SOD活性分別增加了88.28%、39.68%。說明PEG引發(fā)處理可以幫助小冠花幼芽抗氧化酶維持在更高的活性水平。

表3 10%PEG引發(fā)處理下小冠花幼芽CAT、POD和SOD活性

3 討論

種子引發(fā)由Heydecker W提出[2]，在一些發(fā)達國家已作為部分蔬菜、花卉作物種子的播前處理技術(shù)，旨在控制條件使種子前期緩慢吸水但不發(fā)生可見萌發(fā)。其原理是控制種子吸水，使種子處于DNA修復(fù)、酶活化準(zhǔn)備和萌發(fā)所需物質(zhì)代謝提前啟動的發(fā)芽代謝狀態(tài)[3-4]。PEG引發(fā)可提高多種植物種子發(fā)芽率和出苗率一致性，同時增加幼苗株高、鮮重等[5-8,23]。本研究中，0%～20%PEG引發(fā)處理均顯著提高了2個品種小冠花種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)，顯著提高綠寶石(LBS)小冠花種子活力指數(shù)，20%PEG引發(fā)處理則無明顯促進作用。這與前人研究15%PEG引發(fā)可顯著提高甘藍種子活力[24]、40%PEG引發(fā)可顯著提高甜菜種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的結(jié)果類似[25]。表明適宜濃度PEG引發(fā)處理可以促進植物種子萌發(fā)，但不同植物品種對PEG引發(fā)濃度響應(yīng)不同。在本研究中，10%PEG處理能顯著促進小冠花幼芽的生長，30%PEG處理下小冠花幼芽生長和鮮重均降低，說明高濃度的PEG引發(fā)對小冠花幼苗生長抑制。

植物積累脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以提高細胞內(nèi)滲透勢，維持細胞內(nèi)膨壓，防止細胞過度失水[26-27]，穩(wěn)定細胞器結(jié)構(gòu)，維持細胞內(nèi)正常的新陳代謝[28]。PEG可以減緩種子在萌發(fā)初期吸收水分的速率，減少種子在吸收水分的過程中膜系統(tǒng)受到的損傷和對受損膜系統(tǒng)的修復(fù)[29]。本研究中，10%PEG引發(fā)處理下，小冠花幼芽脯氨酸、可溶性蛋白含量顯著升高，與王彥榮等[30]對紫花苜蓿的研究結(jié)果類似。膜結(jié)構(gòu)的完整性是維持種子活力的基礎(chǔ)，干燥的種子快速吸水會造成膜損傷，引起其功能的異常，物質(zhì)外滲量增加，種子活力下降[31]。經(jīng)PEG引發(fā)處理，2個品種小冠花幼芽的電解質(zhì)滲透率均低于對照。這與PEG引發(fā)對芹菜種子幼芽影響的研究結(jié)果一致[32]。表明PEG引發(fā)能夠提高小冠花幼芽滲透物質(zhì)的積累能力，維持細胞繼續(xù)生長，保護了細胞膜結(jié)構(gòu)。

引發(fā)會引起抗氧化酶系統(tǒng)(CAT、POD和SOD酶)的增強，使自由基的清除能力得到提高，膜脂過氧化降低[33]。本試驗在PEG引發(fā)處理下小冠花幼芽CAT、SOD和POD活性較CK處理顯著升高。這在蔡春菊等對毛竹[34]和孫園園等對水稻[4]的研究結(jié)果相似。表明PEG能夠通過提升小冠花抗氧化酶活性，減少膜脂過氧化，保護膜結(jié)構(gòu)的完整性，增強幼芽應(yīng)對外界環(huán)境的適應(yīng)能力。

4 結(jié)論

適宜濃度的PEG引發(fā)處理對小冠花種子萌發(fā)和幼芽生長具有明顯的促進作用，表現(xiàn)為提升了種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，并增加了幼芽的重量以及根長和芽長。但超出最高PEG 引發(fā)濃度的閾值(20%PEG引發(fā))，會影響種子正常萌發(fā)和幼芽生長。PEG引發(fā)可誘導(dǎo)小冠花通過增加脯氨酸和可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，提升幼芽滲透調(diào)節(jié)能力。并通過提高CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性，降低細胞膜脂過氧化和電解質(zhì)外滲，保護細胞結(jié)構(gòu)完整性。建議在小冠花的培育種植前用10%PEG引發(fā)處理，以促進種子萌發(fā)和幼芽生長，增強小冠花的適應(yīng)能力。