劉振成 張碩 代艾林 韓梅 楊利民 張永剛

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春，130118)

朝鮮淫羊藿(Epimediumkoreanum)為小檗科(Berberidaceae)多年生草本植物，多生于疏林下、灌叢間或林緣半陰環(huán)境[1]，分布于吉林省南部、遼寧省東部、朝鮮北部[2-3]。朝鮮淫羊藿作為傳統(tǒng)藥材淫羊藿的重要基原，以干燥葉入藥，具有補腎陽，強筋骨，祛風濕等功能[4-6]。目前，朝鮮淫羊藿人工栽培尚未形成規(guī)模，其藥材商品長期依賴于野生資源，因需求不斷增加造成野生資源急劇減少，各地的藥材質量參差不齊[7]。

土壤是植物賴以生存的物質基礎，是植物吸收養(yǎng)分和水分的場所，土壤理化性質和無機元素對植物生長發(fā)育和藥效成分具有重要的影響[8-12]。相關研究表明，影響藥用植物有效成分含量的土壤主導因子不盡相同[13-16]。目前，關于朝鮮淫羊藿研究主要集中于化學成分、藥理、質量評價等方面[17-18]，尚有部分學者開展生態(tài)環(huán)境對朝鮮淫羊藿化學成分及生長發(fā)育規(guī)律研究[19-20]，而關于朝鮮淫羊藿有效成分與土壤因子相關性的研究尚未見報道。本研究對不同產(chǎn)地朝鮮淫羊藿有效成分質量濃度與其生長的土壤因子進行多元統(tǒng)計分析，探尋影響朝鮮淫羊藿藥材質量的土壤主導因子，為朝鮮淫羊藿適宜種植區(qū)的選擇，開展規(guī)范化種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年8月中旬在吉林省不同地區(qū)(通化、集安、白山、撫松、臨江、敦化)采集野生朝鮮淫羊藿樣品26個(見表1)，并記錄樣地海拔及經(jīng)緯度，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學張永剛副教授鑒定為朝鮮淫羊藿樣品植株，土壤樣品為所取植株根際土壤，與取植株樣品時一并取回，置于室內(nèi)自然風干，粉碎過篩。

1.2 朝鮮淫羊藿化學成分的測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定朝鮮淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷有效成分質量濃度。精密稱定樣品粉末0.5 g(0.425 mm孔徑)置于50 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)70%的乙醇20 mL，稱定質量，20 ℃超聲提取1 h，放冷，再稱定質量，用體積分數(shù)70%的乙醇補足損失質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液作供試品溶液用于質量濃度測定；總黃酮質量濃度參照2015年版《中國藥典》淫羊藿項下總黃酮質量濃度測定方法[1]進行測定。精密量取總黃酮醇苷項下的供試品溶液0.5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，作為對照品溶液。分別取供試品溶液和對照品溶液，以相應試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在270 nm波長處測定吸光度，計算，即得。

表1 朝鮮淫羊藿采集點信息

色譜條件：Agilent Zorbox C18色譜柱(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長270 nm，進樣量10 μL，流動相A為乙腈、C為水，梯度洗脫(0～25 min，體積分數(shù)24%A、體積分數(shù)76%B；25～30 min，體積分數(shù)24%～30%A、體積分數(shù)76%～70%B)。

1.3 土壤元素測定

土壤pH采用pH計測定(梅特勒-托利多儀器上海有限公司SevenMulti型離子綜合測試儀)；土壤堿解氮(N)采用堿解擴散法進行測定；土壤速效磷(P)采用紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)測定；土壤中速效鉀(K)、有效鈣(Ca)、有效鎂(Mg)、有效鐵(Fe)、有效銅(Cu)、有效鋅(Zn)、有效錳(Mn)元素質量分數(shù)采用火焰原子吸收儀(島津AA-6300型原子吸收儀)進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，DPS進行通徑分析及多元回歸分析。

2 結果與分析

2.1 朝鮮淫羊藿化學成分描述性統(tǒng)計

由表2可見，朝藿定A、B、C、淫羊藿苷變異系數(shù)為56.3%～89.8%，屬于高度變異，總黃酮變異系數(shù)為31.7%，屬于中等變異，說明不同產(chǎn)地間朝鮮淫羊藿化學成分質量濃度差異較大，品質相對不穩(wěn)定。2015版《中國藥典》規(guī)定淫羊藿苷、總黃酮為朝鮮淫羊藿化學成分主要評價標準，含量分別不低于0.5%、5.0%符合用藥標準。朝鮮淫羊藿主要化學成分淫羊藿苷質量濃度較高的地區(qū)為通化、集安地區(qū)，較低的地區(qū)為敦化、撫松等地，且未達到藥典規(guī)定標準，總黃酮質量濃度較高區(qū)域為通化地區(qū)，較低區(qū)域為撫松地區(qū)，說明通化地區(qū)更適合朝鮮淫羊藿化學成分合成，藥材質量較好。

表2 朝鮮淫羊藿主要化學成分描述性統(tǒng)計

2.2 朝鮮淫羊藿土壤因子描述性統(tǒng)計

由表3可知，pH平均值為6.26±0.62，變異系數(shù)為9.9%，屬于小范圍變異，說明朝鮮淫羊藿適宜在弱酸性土壤中生長；有機質變幅為2.1%～6.2%，平均值為(4.048±0.929)%，變異系數(shù)為23.0%；土壤無機元素，鐵、銅、鋅、錳、鈣、鎂變異系數(shù)均為高度變異，不同樣地間土壤無機元素質量分數(shù)各不相同，其中銅變異系數(shù)最大，分布極不均衡；速效磷變幅為21.74～563.30 mg·kg-1，平均值為(130.38±95.80)mg·kg-1，變異系數(shù)為73.5%，速效磷質量分數(shù)較高但不均衡；堿解氮變異系數(shù)為26.0%，含量豐富，較為均衡；速效鉀質量分數(shù)中等，但不均衡；海拔變幅為360～670 m，均值為(482.00±72.14)m，變異系數(shù)為15.0%，變異系數(shù)較小，說明朝鮮淫羊藿生長的海拔較為穩(wěn)定，朝鮮淫羊藿適宜生長在低海拔地區(qū)。

表3 朝鮮淫羊藿土壤因子描述性統(tǒng)計

2.3 土壤因子與化學成分相關性

由表4可知，朝藿定A與有效鎂呈極顯著正相關，朝藿定B與pH、有效鈣呈負相關，與有效鎂呈極顯著正相關，朝藿定C與有效鈣呈負相關，與有效鎂呈極顯著正相關，淫羊藿苷與有效鈣呈負相關，與有效鎂呈極顯著正相關，總黃酮與有效鋅呈負相關。表明有效鎂有利于朝藿定A、B、C、淫羊藿苷的合成，高pH不利于朝藿定B的質量濃度積累，有效鈣過高抑制朝藿定B、C、淫羊藿苷的化學成分形成，有效鋅過高不利于總黃酮質量濃度積累。

表4 土壤因子與淫羊藿化學成分相關性

2.4 土壤因子與朝鮮淫羊藿化學成分灰色關聯(lián)度

分別以朝藿定A、B、C、淫羊藿苷、總黃酮作為母因素，以土壤因子為子因素對原始數(shù)據(jù)進行標準化，進行灰色關聯(lián)度分析。結果如表5所示，各化學成分與土壤因子關聯(lián)系數(shù)較高，說明它們之間關系密切，影響朝藿定A的主要土壤因子是有效銅、有效鈣、速效鉀，影響朝藿定B的主要土壤因子是速效磷、有效銅、速效鉀，影響朝藿定C的主要土壤因子是有效銅、有效鈣、有效鋅；影響淫羊藿苷的主要土壤因子是速效磷、有效銅、有效鈣；影響總黃酮的主要土壤因子是速效磷、有效鈣、有效銅。

表5 土壤因子與朝鮮淫羊藿化學成分灰色關聯(lián)度

2.5 土壤因子對朝鮮淫羊藿化學成分通徑分析

由表6可知，土壤因子對朝藿定A的直接通徑系數(shù)的絕對值較大的為：有效鈣(0.689)、有機質(0.350)、海拔(-0.303)，說明有效鈣、有機質、海拔對朝藿定A的直接效應最大，其中有效鈣、有機質為正效應，海拔為負效應，有效鈣、有機質質量分數(shù)較高的地區(qū)有利于朝藿定A質量濃度的積累，高海拔不利于朝藿定A質量濃度的積累，這也符合朝鮮淫羊藿適宜生長在低海拔地區(qū)的特性。土壤因子對朝藿定B的直接通徑系數(shù)絕對值較大的為有效鈣(0.699)、有效鎂(-0.475)、有效銅(-0.335)；土壤因子對朝藿定C的直接通徑系數(shù)絕對值較大的為有效鈣(0.813)、有效鎂(-0.507)、有效銅(-0.274)；土壤因子對淫羊藿苷的直接通徑系數(shù)絕對值較大的為有效鈣(0.725)、有效鎂(-0.382)、有效銅(-0.231)。有效鈣、有效鎂、有效銅是對朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷直接通徑系數(shù)絕對值較大且直接效應較大的3個土壤因子，其中有效鈣為正效應，有效鎂、有效銅為負效應，說明有效鈣質量分數(shù)較高地點有利于朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷質量濃度的形成，土壤中有效鎂、有效銅質量分數(shù)過高會抑制朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷質量濃度的積累。由表6可知，土壤因子對總黃酮的直接通徑系數(shù)的絕對值較大的為：有效鎂(-0.795)、有機質(0.699)、有效鈣(0.497)速效磷(-0.491)，有效鎂、有效鈣、有機質、速效磷對總黃酮直接效應最大，其中有效鈣、有機質為正效應，有效鎂、速效磷為負效應，表明土壤中有機質質量分數(shù)豐富、有效鈣質量分數(shù)較高的地區(qū)，有利于總黃酮質量分數(shù)的積累，過高的有效鎂、速效磷會抑制總黃酮的積累。

表6 土壤因子對朝鮮淫羊藿化學成分通徑分析

2.6 淫羊藿化學成分與土壤因子多元回歸分析

在相關性分析、灰色關聯(lián)度分析、通徑分析基礎上，通過多元逐步回歸分析剔除對因變量不起作用的因子。以朝鮮淫羊藿5種化學成分為因變量，12個土壤因子為自變量，建立回歸方程，挑選主要影響因子。方程如表7所示，當有效鈣質量分數(shù)(x4)增加一個單位時，朝藿定A質量濃度增加0.046 96%；當有效鈣(x4)和有效鎂(x5)處于平均水平，而其中一個變量固定時，剩余變量如有效鈣(mg·kg-1)和有效鎂(mg·kg-1)每增加一個單位，朝藿定B質量濃度分別增加0.000 07%和減少0.000 06%，朝藿定C質量濃度分別增加0.000 06%和減少0.000 04%，淫羊藿苷質量濃度分別增加0.000 37%和減少0.000 3%；當有機質(x3)、有效鈣(x4)、有效鎂(x5)、速效氮(x11)處于平均水平，而其中一個變量固定時，剩余變量如有機質(mg·kg-1)、有效鈣(mg·kg-1)、有效鎂(mg·kg-1)、速效氮(mg·kg-1)每增加一個單位，總黃酮質量濃度分別增加2.090%、0.002%和減少0.004%、0.010%。

表7 朝鮮淫羊藿化學成分與土壤因子多元逐步回歸分析

為了更加明確土壤因子對朝鮮淫羊藿化學成分質量濃度的影響，對土壤因子與朝鮮淫羊藿化學成分重新做通徑分析。由表8可知，影響朝藿定A質量濃度的決定因子是有效鈣；有效鈣、有效鎂是影響朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的決定因子，有機質、有效鈣、有效鎂、堿解氮是影響總黃酮的決定因子。

表8 淫羊藿化學成分與土壤決定因子的通徑分析

3 討論

生態(tài)因子是影響藥材質量的重要因素，不同生態(tài)因子對藥材結構、性狀、藥效成分等產(chǎn)生不同程度的影響，即環(huán)境飾變導致同種異地藥材質量的不同[21]。生態(tài)因子中土壤因子是直接影響中藥材生長發(fā)育以及產(chǎn)量品質的一個關鍵性因子，是中藥材生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中的限制因子[22]。不同地區(qū)土壤因子存在差別，致使生長在不同地區(qū)的同種藥材化學成分存在顯著差異，本研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地野生朝鮮淫羊藿化學成分含量差異較大，同一地區(qū)不同樣地野生朝鮮淫羊藿化學成分也存在較大差異，總體上通化地區(qū)化學成分質量分數(shù)要高于其他地區(qū)。土壤是一個很好的“儲藏室”，儲存水分、空氣、礦質元素，這些都是植物生長發(fā)育及化學成分合成所必需的要素，土壤對藥材品質具有重要影響。楊月等[23]研究發(fā)現(xiàn)，K、Mg對三七藥材品質有著重要影響；徐琳娜等[24]在對茂蘭地區(qū)鐵皮石斛適應性研究中發(fā)現(xiàn)，野生的鐵皮石斛在Ca元素較高的石灰石上生長得最好；Ca、Mg元素是植物體內(nèi)某些酶的活化劑，對植物的呼吸作用以及其他礦質元素的吸收都會產(chǎn)生影響，進而影響植物的生長和代謝[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同土壤因子變異系數(shù)也呈現(xiàn)高度變異，但海拔、pH均屬于小變異，說明朝鮮淫羊藿適宜生長在低海拔、弱酸性土壤中。本研究通過簡單相關性、灰色關聯(lián)度分析、通徑分析、多元回歸分析多方法共同闡釋土壤因子對化學成分的影響，最終結果指出有效鈣與朝藿定A呈顯著正相關關系，在回歸方程中也僅有效鈣與朝藿定A呈顯著回歸。有效鈣(正相關)、有效鎂(負相關)、有效銅(負相關)是影響朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的主要影響因子，但僅有有效鈣、有效鎂與朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷質量濃度形成回歸方程，增加土壤中有效鈣質量分數(shù)、減少有效鎂質量分數(shù)有利于增加朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的質量濃度。相關性分析中朝藿定B、C、淫羊藿苷與有機質呈負相關，但在回歸方程中并沒有顯著回歸，可能因子間存在多重共線性。有效鎂(負相關)、有效鈣(正相關)、有機質(正相關)、堿解氮(負相關)是影響總黃酮主要因素，且形成二元回歸方程，說明土壤肥沃，有效鈣質量分數(shù)較高的地區(qū)，減少有效鎂、堿解氮質量分數(shù)有利于總黃酮質量濃度增加。

朝鮮淫羊藿有效成分的質量濃度除了受土壤因子的影響外，還與自身遺傳和產(chǎn)地的光照、降水量、溫度等氣象因子及地形因子密切相關。綜合考慮包含氣象因子、地形因子及土壤因子對朝鮮淫羊藿的產(chǎn)量及有效成分含量的影響，才能更好地為確定朝鮮淫羊藿的適宜產(chǎn)地及開展人工種植提供理論依據(jù)，這將是進一步研究的方向。

4 結論

朝鮮淫羊藿化學成分與土壤因子變異系數(shù)均較大。通過相關性分析、灰色關聯(lián)度分析、通徑分析、多元回歸分析，層層深入，多方法緊密結合，明確影響化學成分主要土壤因子：朝藿定A為有效鈣；朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷為有效鈣、有效鎂；總黃酮為有機質、有效鈣、有效鎂、堿解氮。綜上所述，影響朝鮮淫羊藿化學成分主要生態(tài)因子是有效鈣、有效鎂、有機質、堿解氮。在低海拔、弱酸性土壤中，增加有效鈣、減少有效鎂有利于增加朝鮮淫羊藿化學成分質量濃度，但在土壤肥力較高地區(qū)，減少堿解氮更有利于增加總黃酮質量濃度。