何廣輝 董蒙 武斌 梁澤玉 陳松

視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)位于視網(wǎng)膜結(jié)構的最外層，由單層規(guī)律排列的RPE細胞組成，在維持視網(wǎng)膜功能方面起著至關重要的作用。此外，RPE細胞還具有光吸收、光氧化保護、吞噬脫落的光感受器細胞膜盤以及參與離子和液體轉(zhuǎn)運等功能[1]。臨床上，一些嚴重影響視力的眼科疾病，例如年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)[2]和視網(wǎng)膜色素變性(retinal pigmentosa,RP)[3]等的發(fā)生、進展都與RPE細胞的退行性改變有關。RPE細胞在增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的發(fā)病機理中起著重要作用[4-8]，PVR的過程涉及許多類型的細胞，包括成纖維細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞和巨噬細胞，尤其是RPE細胞。相關研究表明，PVR的產(chǎn)生與RPE細胞的增殖與遷移狀態(tài)發(fā)生變化有關[7]。目前，一些抑制RPE細胞增殖和凋亡的藥物已用于實驗和臨床應用。此外，近年來，研究集中在RPE細胞中相關細胞因子的調(diào)控上[9-11]。

microRNAs(miRNAs)是真核細胞一類非編碼的、穩(wěn)定的、可調(diào)控的核糖核酸分子，可作用于其靶基因信使RNA(mRNA)3’端的非編碼區(qū)堿基，引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯，參與到細胞進化、細胞增生、細胞凋亡、腫瘤和免疫反應等生物學過程中，調(diào)節(jié)人類三分之一基因的表達。miR-21作為一種致癌miRNA，在腫瘤領域尤其引人關注。miRNA-21通過對相關靶基因的調(diào)節(jié)參與多數(shù)腫瘤細胞凋亡、侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移及血管生成等過程，近年來miRNA在視網(wǎng)膜色素上皮細胞增殖和凋亡中的研究逐漸增多[12]。有研究證明，miR-21在H2O2誘導的人眼小梁網(wǎng)細胞氧化應激損傷過程中異常表達[13]，因此本研究旨在探討miRNA-21通過對Erk信號通路的影響，從而對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增殖和侵襲和凋亡的機制的研究。

資料與方法

一、材料

人視網(wǎng)膜色素上皮細胞系ARPE-9購自美國ATCC細胞庫。miR-21 mimics，miR-21 inhibitors以及對照物由百奧邁科生物技術有限公司訂購合成，鼠源β-actin單克隆抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司)、兔源Erk單克隆抗體(密理博有限公司)、胎牛血清(上海玉博生物科技有限公司)、SYBR?Green Master Mix(諾唯贊生物科技有限公司)、高糖DMEM培養(yǎng)基(上海玉博生物科技有限公司)、胰蛋白酶(上海生工生物工程有限公司)、ECL發(fā)光液(碧云天生物技術有限公司)、Lipofectamine TM 3000試劑盒(美國Gibco公司)、FACSCanto流式細胞儀(美國BD公司)，二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔(美國Cell Signal Technology)，二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠(美國Cell Signal Technology)。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：ARPE-9細胞無菌培養(yǎng)于含10%的胎牛血清、1%的雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)以及傳代。收集穩(wěn)定傳代細胞進行計數(shù)后接種，以每孔400 ×103個接種到細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)至細胞融合達到80%左右，更換為不含新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，按照LipofectamineTM3000試劑盒操作說明書進行轉(zhuǎn)染。將細胞分為4組：(1)空白對照組，(2)陰性對照組，(3)miR-21 mimics，(4)miR-21 inhibitors。每孔均加入1.5 μl Lipofectamine RNAiMAX，此外每組分別按空白對照不添加，陰性對照添加0.7 μl 20 μmol/l miR-21陰性對照物，miR-21 mimics添加0.7 μl 20umol/l miR-21 mimics，miR-21 inhibitors添加0.7 μl 20umol/L miR-21 inhibitors，每組設置6個重復。轉(zhuǎn)染后進行常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，供后續(xù)檢測。

2.實時熒光定量PCR法檢測miR-21，Erk基因的表達：各組收集細胞后，Trizol法提取總的RNA，之后取出1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，Q-PCR法擴增cDNA片段，序列如下：miR-21上游5’ CGCATCGTTACCATCATCACG 3’，下游5’ TTCTTCCTCTGTCCGACGGTCT 3’， Erk上游5’ ATCCCAGTTCAATCGCCG 3’，下游5’ AATCACTGGCTTACGGCCTCCG3’，U6上游5’ ATTGGAACGATACAGAGAAGATT3’，下游5’ GAACGCTTCACGAATTTG3’。Q-PCR反應體系：Mix 10 μl，primer F 0.4 μl，primer R 0.4 μl，Rox 0.4 μl，CDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循環(huán)40次，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

3.Western Blot 檢測Erk蛋白的表達：將細胞收集在1.5 ml離心管中，進行胰蛋白酶處理，以1200 rpm離心5 min，棄去上清液，用1 ml PBS洗滌兩次，以1200 rpm離心min，然后棄去上清液，加入RIPA裂解液，渦旋，混勻，冰浴30 min，4 ℃，12000 rpm，離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，用BCA法定量蛋白質(zhì)。加入6×Lodding緩沖液，充分混合，并在100 ℃下煮沸5 min，以確保蛋白質(zhì)變性。配置聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)定量結(jié)果，取50 μg樣品，用80 V 待Marker分離，然后120 V直至溴酚藍到達凝膠底部，以300 mA的恒定電流轉(zhuǎn)移膜1.5 h，然后用5%脫脂奶的TBST封閉2 h，用兔單克隆抗體Erk(1：2000)，小鼠單克隆抗體β-actin(1：1000)4 ℃下過夜，然后用TBST洗滌3次，每次在搖床上5 min，二抗(1：3000)在室溫下孵育1.5 h，用TBST洗滌3次，每次5 min，用ECl化學發(fā)光溶液顯影，并用Tanon 4500自動化學發(fā)光圖像分析儀掃描。

4.細胞增殖測定：將ARPE-9細胞以每孔5×104個細胞接種在24孔板(BIOFIL，加拿大)中，并按照LipofectamineTM3000試劑盒操作說明進行轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染48 h后用Cell Titer 96 aQueous分析試劑盒(美國Promega)檢測細胞增殖，MTS分析檢測到72 h后細胞增殖。

5.Transwell侵襲測定：各組轉(zhuǎn)染后的細胞作為單細胞懸浮液在無血清DMEM培養(yǎng)基中收獲，并將150 ul細胞懸浮液(3×104個細胞)接種在上室(Corning，New York，USA)中。同時，下室為充滿600 μl補充有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。對于侵襲測定，在將細胞接種到室中之前，將室用基質(zhì)膠包裹6 h。37 ℃孵育12 h后，細胞用冰冷的甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min。在200%結(jié)晶紫的顯微鏡下獲取圖像5 min，圖像是細胞用冰球重復固定。

6.Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡：取對數(shù)生長期的細胞，按照分組接種于六孔板中，分別轉(zhuǎn)染處理，到達時間后收集細胞，PBS 洗滌2 次，取3×105個細胞，加入195 μl 結(jié)合液重懸細胞，之后加入5 μl AnnexinV-FITC，混勻，常溫避光孵育10 min，離心，棄上清。加入200 μl 結(jié)合液輕輕重懸細胞，加入20 μl PI混勻，將樣品用錫紙包裹，1 h 內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。

三、統(tǒng)計學分析

兩組之間比較采用t檢驗，P<0.05表示有顯著差異。 數(shù)據(jù)分析是通過GraphPad Prism5進行。

結(jié) 果

一、Q-PCR法檢測miR-21基因，Erk基因的表達

結(jié)果如圖1 ，miR-21 mimics 組與陰性對照組相比miR-21和Erk表達水平明顯上調(diào)，miR-21 inhibitors 組與陰性對照組相比miR-21和Erk表達水平明顯下調(diào)，而空白對照組和陰性對照組無明顯差異，此結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒成功實現(xiàn)miR-21，Erk表達水平的上調(diào)和下調(diào)。

圖1 各組miR-21，Erk基因表達比例柱形圖

二、Western法檢測Erk蛋白的表達水平

結(jié)果如圖2所示，miR-21 mimics 組與陰性對照組相比Erk蛋白表達水平明顯上調(diào)，miR-21 inhibitors 組與陰性對照組相比Erk蛋白表達水平明顯下調(diào)，而空白對照組和陰性對照組無明顯差異，此結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.001)。

圖2 各處理組Erk蛋白表達水平(A)以及蛋白表達水平柱形圖(B)

三、MTT法檢測四組ARPE-9細胞的增殖能力

如圖圖 3，miR-21 mimics 組與陰性對照組相比細胞增殖能力明顯上調(diào)， miR-21 inhibitors 組與陰性對照組相比細胞增殖能力明顯下調(diào)，而空白對照組和陰性對照組無明顯差異，此結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，(P<0.001，P<0.01)。

圖3 各處理組ARPE-9細胞增殖比例柱形圖

四、transwell檢測四組ARPE-9細胞的侵襲

如圖4所示，miR-21 mimics 組與陰性對照組相比細胞侵襲能力明顯上調(diào)， miR-21 inhibitors 組與陰性對照組相比細胞侵襲能力明顯下調(diào)，而空白對照組和陰性對照組無明顯差異，此結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，(P<0.001)。

圖4 四組細胞的侵襲情況

五、流式細胞儀檢測細胞的凋亡

如圖圖5所示， miR-21 mimics 組與陰性對照組相比細胞凋亡水平明顯下調(diào)， miR-21 inhibitors 組與陰性對照組相比細胞凋亡水平明顯上調(diào)，而空白對照組和陰性對照組無明顯差異，此結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖5 四組細胞的凋亡水平

討 論

PVR是由視網(wǎng)膜脫離后增生的纖維化組織形成引起的并發(fā)癥，可引起視力喪失或失明[14，15]。 在PVR中，RPE細胞顯著促進視網(wǎng)膜上纖維組織的發(fā)育[16]，而miRNA廣泛分布HT在角膜，視網(wǎng)膜和晶狀體及其他眼組織細胞中，在正常的眼組織中表現(xiàn)出特異性表達。它在眼組織的生長發(fā)育，分化，損傷后的組織再生以及晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)中起重要作用。miRNA的突變或異常表達會影響正常組織細胞的生長、增殖、分化和凋亡并導致細胞惡性生長。Erk通路可參與調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡等多種細胞生物學過程。

本研究首先通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實現(xiàn)ARPE-9細胞中miR-21表達水平的改變，之后通過對細胞增殖，侵襲，凋亡水平的檢測表明miR-21的上調(diào)促進細胞的增殖和侵襲，抑制細胞凋亡，同時增加Erk蛋白的表達水平。

綜上所述，我們的研究初步揭示miR-21通過Erk信號通路調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜色素上皮細胞的增殖和侵襲和凋亡，相關機制需要進一步研究。