楊 坤，李 斌，李萬榮，辛?xí)匀?/p>

(1.青海大學(xué)，青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.青海省果洛藏族自治州人民醫(yī)院，青海 果洛 814000；4.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院眼科，四川 成都 610072)

急進(jìn)海拔3 500 m以上高原可誘發(fā)高海拔視網(wǎng)膜病(high altitude retinopathy，HAR)，包括視網(wǎng)膜出血、視盤水腫等視網(wǎng)膜病理性改變。我們前期運(yùn)用低壓氧艙模擬急進(jìn)高原環(huán)境進(jìn)行HAR相關(guān)病理損害機(jī)制的研究提示，急性低壓缺氧通過對視網(wǎng)膜凋亡信號傳導(dǎo)通路、功能相關(guān)蛋白、視網(wǎng)膜線粒體及DNA功能的影響可致視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害，引起視網(wǎng)膜病理性改變[1-3]。我們進(jìn)一步推測急性低壓缺氧在導(dǎo)致視網(wǎng)膜內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)失衡的同時可能會促發(fā)炎癥介質(zhì)的異常表達(dá)，加重急性低壓缺氧對視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激的損害。因此，本研究進(jìn)一步探討急進(jìn)高原對大鼠視網(wǎng)膜抗氧化應(yīng)激能力和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的影響，以及可能的病理機(jī)制。由于苓桂術(shù)甘湯加黃芪、三七組成的加味苓桂術(shù)甘湯(Jiawei Linggui Zhugan Decoction，JLZD)具有一定的抗炎、抗氧化應(yīng)激作用[4，5]，故本研究探討JLZD對急進(jìn)高原環(huán)境所致視網(wǎng)膜損害的干預(yù)作用。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選取SPF級健康無眼疾8 w雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量(215±12)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(陜)2018-001。使用隨機(jī)數(shù)字法把大鼠分為空白對照組(空白組，24只)、高原組(24只)、JLZD干預(yù)組(24只)?？瞻捉M大鼠飼養(yǎng)于海拔為2 200 m的西寧地區(qū)，高原組、JLZD干預(yù)組大鼠送往海拔為4 270 m的果洛地區(qū)。

1.1.2 藥物制備

JLZD組成：黃芪60 g，三七12 g，茯苓32 g，桂枝24 g，白術(shù)24 g，甘草16 g，中藥飲片均購自青海省中醫(yī)院，使用全自動煎藥機(jī)煎制，藥液生藥含量：1.29 g·mL-1。

1.1.3 主要試劑與儀器選擇

ELISA法大鼠白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)試劑盒，比色法超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(WST-1法)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)(TBA法)試劑盒均購自武漢伊萊瑞特公司；核因子-κB p65(nuclear factor kappaB p65，NF-κB p65)抗體購自PST公司；HRP山羊抗兔二抗購自Jackson ImmunoResearch公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)購自TAKARA公司，Power SYBR Green PCR Master Mix購自Thermo公司。熒光定量PCR儀購自ABI公司，電動組織研磨器套裝購自天根生化公司，酶標(biāo)儀購自南京德鐵公司。引物由上海生工合成(PAGE純化)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 給藥方法

JLZD干預(yù)組大鼠每天灌胃1次(JLZD水煎劑17.59g·kg-1)，空白組、高原組每天灌胃1次(等量生理鹽水)，均連續(xù)7天。

1.2.2 樣本取材方法

急進(jìn)高原第7天，各組大鼠麻醉下摘取眼球，在體視顯微鏡下使用眼科顯微剪在鋸齒緣上約0.5 mm處做環(huán)形剪開，制作成視杯，用顯微鑷完整剝離視網(wǎng)膜置凍存管，以液氮凍存。樣本取材結(jié)束后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 視網(wǎng)膜IL-6、IL-1β含量檢測方法

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELSIA)。取大鼠視網(wǎng)膜組織稱重后用冰浴研磨法制作10%組織均漿。用BCA法檢測10%組織均漿總蛋白濃度，用樣本稀釋液稀釋、調(diào)整各樣本總蛋白濃度使之一致，計(jì)算各樣本稀釋倍數(shù)。用ELSIA法檢測IL-6、IL-1β蛋白含量，用酶標(biāo)儀測定吸光度用作標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，根據(jù)說明書公式計(jì)算各樣本IL-6、IL-1β蛋白含量。

1.2.4 視網(wǎng)膜MDA含量、SOD活力檢測方法

應(yīng)用比色法。用TBA法檢測MDA含量：用BCA法檢測各樣本總蛋白濃度，繪制MDA標(biāo)準(zhǔn)曲線。將10%視網(wǎng)膜組織勻漿用1×PBS液稀釋30倍后以WST-1法檢測SOD活力，用BCA法檢測各樣本總蛋白濃度，按照試劑盒說明書公式分別計(jì)算各樣本MDA含量、SOD活力。

1.2.5 視網(wǎng)膜組織NF-κB p65表達(dá)檢測方法

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法。將眼球固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液后脫水、浸蠟、包埋，制作4 μm石蠟切片、貼片。行常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度灑精脫水、抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，滴加NF-κB p65一抗(1：500)孵育(4℃，過夜)，滴加辣根酶標(biāo)記二抗(1：1000)孵育(37℃，30min)，用DAB顯色(5min)，以純凈水終止顯色。用蘇木素復(fù)染后脫水并作透明處理，用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取不同的視野觀察NF-κB p65表達(dá)情況。

1.2.6 視網(wǎng)膜低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、NF-κB、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)mRNA相對表達(dá)量檢測方法

應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR法。取10%視網(wǎng)膜組織均漿，使用超純RNA提取試劑盒提取總RNA，檢測純度和濃度。mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，60 min；85 ℃，5 s。熒光定量PCR擴(kuò)增：配制20 μL PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：50.0 ℃，2 min；95.0 ℃，2 min；95 ℃，15s；60 ℃，60s(循環(huán)40次)。熔解曲線條件：95.0 ℃ ，15 s；60.0 ℃，60 s；95.0 ℃，15 s。以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量，所有樣本重復(fù)檢測3次，取平均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-κB p65表達(dá)情況

高原組大鼠視網(wǎng)膜外叢狀層、外核層較空白組疏松，JLZD干預(yù)組較高原組為好。免疫組化結(jié)果顯示，NF-κB p65在空白組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層及內(nèi)核層呈弱陽性表達(dá)，而在高原組陽性表達(dá)增強(qiáng)。經(jīng)JLZD干預(yù)后，NF-κB p65在視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層及內(nèi)核層的陽性表達(dá)強(qiáng)度與高原組相比較弱。見圖1。

A：空白組；B：高原組；C：JLZD干預(yù)組

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達(dá)量

高原組視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB、TNF-α mRNA的相對表達(dá)量均升高，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)。經(jīng)JLZD干預(yù)后，JLZD干預(yù)組HIF-1α mRNA相對表達(dá)量降低，與高原組比較有差異(P=0.011)，JLZD干預(yù)組的NF-κB、TNF-α mRNA相對表達(dá)量降低，與高原組比較有差異(P=0.009、0.001)。JLZD干預(yù)組的HIF-1α、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達(dá)量與空白組比較均無差異(均P>0.05)。數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、NF-κB、TNF-α mRNA相對表達(dá)量

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜MDA含量、SOD活力

高原組大鼠視網(wǎng)膜的MDA含量升高、SOD活力降低，與空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)。經(jīng)JLZD干預(yù)后，JLZD干預(yù)組的SOD活力顯著升高、MDA含量顯著降低，JLZD干預(yù)組SOD活力升高，與高原組比較有差異(P<0.001)，JLZD干預(yù)組的MDA含量降低，與高原組比較有差異(P=0.001)，其中SOD活力升高較為顯著。JLZD干預(yù)組的SOD活力、MDA含量與空白組比較均無差異(均P>0.05)。數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜SOD、MDA含量

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、IL-1β含量

高原組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、IL-1β含量均升高，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.01)。經(jīng)JLZD干預(yù)后，JLZD干預(yù)組的IL-6含量降低，與高原組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)，JLZD干預(yù)組的IL-1β含量降低，與高原組比較有差異(P<0.001)，其中IL-1β含量降低較為顯著。JLZD干預(yù)組的IL-6、IL-1β含量與空白組比較均無差異(均P>0.05)。數(shù)據(jù)詳見表4。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜IL-6、IL-1β含量

3.討論

急進(jìn)高海拔環(huán)境，暴露于急性低壓缺氧是誘發(fā)高原腦水腫、高原肺水腫及HAR的主要原因之一。急性低壓缺氧對人體組織尤其是耗氧量高的神經(jīng)系統(tǒng)影響較大。視網(wǎng)膜作為神經(jīng)系統(tǒng)的延伸部分，對缺氧尤為敏感，在高海拔低壓缺氧環(huán)境下會影響眼部血流調(diào)控機(jī)制，引起視網(wǎng)膜供氧量減少，進(jìn)而影響視網(wǎng)膜功能。

本研究結(jié)果顯示，高原組大鼠視網(wǎng)膜的HIF-1α mRNA相對表達(dá)量、氧化應(yīng)激因子MDA含量均顯著升高，抗氧化酶SOD活力降低。這與我們前期研究發(fā)現(xiàn)急性低壓缺氧可通過HIF-1-硫氧還蛋白相互作蛋白/硫氧還蛋白(HIF-1-Txnip/Trx)信號通路調(diào)控大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)基因，影響視網(wǎng)膜組織線粒體中抗氧化酶錳超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性的結(jié)果一致[1-3]。其病理損害的發(fā)生可能與急性低壓缺氧條件下激發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)從線粒體膜外漏，影響視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，增加細(xì)胞通透性，進(jìn)而破壞血-視網(wǎng)膜屏障有關(guān)[6]。HIF-1是細(xì)胞應(yīng)對缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，HIF-1α表達(dá)增加并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，改變負(fù)責(zé)線粒體氧化磷酸化的細(xì)胞色素鏈的活性，導(dǎo)致ATP合成減少致ROS生成增加[7]。HIF-1α也可直接被招募到線粒體，調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄，參與多種氧化應(yīng)激相關(guān)疾病[8]。視網(wǎng)膜膜脂中富含多不飽和脂肪酸對氧化應(yīng)激反應(yīng)非常敏感，MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，與高原腦損傷程度密切相關(guān)[9]。SOD作為重要的抗氧化酶之一，可與超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)抵抗氧化應(yīng)激損害。視網(wǎng)膜MDA含量、SOD的活力可反映視網(wǎng)膜的氧化應(yīng)激狀態(tài)[10]。因此，本研究中高原組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α mRNA的相對表達(dá)量、MDA含量升高，SOD活力降低可綜合反映急進(jìn)高原大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生顯著的氧化應(yīng)激損害情況。JLZD干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α mRNA的相對表達(dá)量、MDA含量較高原組均降低，較高原組SOD活力升高，提示JLZD具有通過HIF-1α信號通路抵抗視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害的作用。

本研究結(jié)果顯示，高原組大鼠視網(wǎng)膜中的NF-κB、TNF-α mRNA相對表達(dá)量，以及炎癥因子IL-6、IL-1β含量均顯著增加，視網(wǎng)膜組織的NF-κB p65表達(dá)增加。缺氧激活的信號通路與炎癥信號通路相互交織[11]。氧化應(yīng)激觸發(fā)的炎癥反應(yīng)與NF-κB信號通路密切相關(guān)，并通過HIF-1α信號通路加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，如ROS可激活NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核[12]，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6、TNF-α和IL-1β表達(dá)上調(diào)[13]，在HIF-1α啟動子中存在NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[14]，IL-6、TNF-α和IL-1β等炎癥因子的過度表達(dá)可通過NF-κB依賴的方式激活HIF-1α，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]。NF-κB還是TNF-α促使HIF-1α穩(wěn)定和激活的關(guān)鍵介質(zhì)[16]，NF-κB亞基p65可誘導(dǎo)HIF-1α mRNA和蛋白質(zhì)基礎(chǔ)水平的表達(dá)，如降低NF-κB p65活性可抑制HIF-1α的表達(dá)，減少TNF-α的產(chǎn)生[17]。此外，在NF-κB和HIF-1α的特定功能區(qū)都存在血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)啟動子結(jié)合位點(diǎn)[18]，HIF-1α和NF-κB信號通路在氧化應(yīng)激反應(yīng)促使VEGF的過度生成過程中起協(xié)同作用，如抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可減少VEGF的產(chǎn)生[19]，而VEGF是缺氧性視網(wǎng)膜內(nèi)屏障破壞的重要因素。急性低壓缺氧可增加炎性因子的過度釋放促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，參與視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的損害[10，20]；同時，急性低壓缺氧明顯上調(diào)TNF-α的表達(dá)，可導(dǎo)致RPE間的緊密連接蛋白破壞而損傷視網(wǎng)膜外屏障[21]，共同參與HAR視網(wǎng)膜出血、視盤水腫的病理進(jìn)程。JLZD干預(yù)組視網(wǎng)膜的NF-κB、TNF-α mRNA相對表達(dá)量及IL-6、IL-1β含量均顯著降低，視網(wǎng)膜組織的NF-κB p65表達(dá)減少，提示JLZD具有降低視網(wǎng)膜炎癥因子的作用，可能由此減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害。

綜上所述，急進(jìn)高原大鼠可通過激活NF-κB/HIF-1α信號通路，上調(diào)視網(wǎng)膜的NF-κB、TNF-α mRNA的表達(dá)，增加炎癥因子IL-6、IL-1β含量，同時上調(diào)視網(wǎng)膜HIF-1α mRNA的表達(dá)，引起抗氧化酶SOD活力降低、氧化應(yīng)激因子MDA過量產(chǎn)生，導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜中炎癥介質(zhì)過度表達(dá)而加重視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害。JLZD可調(diào)控NF-κB/HIF-1α信號通路，抑制視網(wǎng)膜炎癥因子過度釋放減輕視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損害。