趙秋媛,楊劍華,王 蕊,張麗珠,楊 敏,張艷麗,王紅斌,譚 偉?

(云南民族大學(xué)1.化學(xué)與環(huán)境學(xué)院;2.民族醫(yī)藥學(xué)院,昆明 650500)

汞是一種有毒的非放射性重金屬元素,對環(huán)境的污染比較嚴(yán)重,尤其是水環(huán)境污染[1]。汞在自然界中廣泛存在,它會通過反應(yīng)轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的甲基汞[2],一旦經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后便無法排出,產(chǎn)生累積性汞中毒[3-4],從而引發(fā)多種疾病甚至死亡。水中汞主要以Hg2＋形式存在,因此建立一種快速、靈敏、方便地測定水中Hg2＋的方法具有重要的實用價值[5-6]。

Hg2＋的傳統(tǒng)測定方法主要有原子吸收光譜法和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法,但這些方法存在樣品前處理步驟復(fù)雜、分析成本昂貴等問題。與傳統(tǒng)方法相比,熒光探針法具有操作簡便、設(shè)備要求不高、可進(jìn)行實時原位檢測、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點,已應(yīng)用于多種金屬離子的測定[7-9]。羅丹明染料具有熒光量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、激發(fā)波長和發(fā)射波長均處于可見光區(qū)以及可形成熒光團(tuán)“開-關(guān)”環(huán)等特點,已被用于金屬離子熒光探針的制備、小分子(如硫醇)測定、單分子成像等研究領(lǐng)域[10-11]。

基于文獻(xiàn)[12],本工作發(fā)現(xiàn)熒光探針羅丹明6G衍生物-谷胱甘肽(Rh6G2-GSH)在4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)-甲醇緩沖溶液中對Hg2＋具有特異性識別作用,并可產(chǎn)生熒光強(qiáng)度和吸光度的變化,據(jù)此建立了熒光分光光度法和紫外-可見分光光度法測定水中Hg2＋含量的方法,以期為水中Hg2＋的測定提供思路。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

5J1-004F-7000型熒光分光光度計;UV 2100型紫外-可見分光光度計;EF 20型pH 酸度計。

Hg2＋標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:0.1 mol·L－1,稱取適量氯化汞,用水溶解和稀釋,配制成濃度為0.1 mol·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,其他所需濃度均由此溶液用水逐級稀釋制得。

GSH 為生物純;羅丹明6G、HEPES均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 熒光分光光度法

激發(fā)波長510 nm;激發(fā)狹縫寬度2.5 nm;掃描范圍520～700 nm;發(fā)射波長555 nm。

1.2.2 紫外-可見分光光度法

電壓400 V;掃描范圍200～800 nm;檢測波長528 nm。

1.3 試驗方法

按文獻(xiàn)[12]報道的方法合成Rh6G2。在50 mmol·L－1HEPES溶液中加入等體積甲醇,配成HEPES-甲醇緩沖溶液(pH 7)。在反應(yīng)瓶中加入2 mL 上述緩沖溶液,再加入1×10－4mol·L－1GSH 溶液3 mL 和1×10－4mol·L－1Rh6G2溶液3 mL,在室溫下自組裝反應(yīng)2 h。

取30μL 經(jīng)0.2 mm 濾膜過濾后的水樣,加入上述Rh6G2-GSH 溶液4 mL,分別按照兩種儀器工作條件進(jìn)行測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 體系酸度的選擇

考察了Rh6G2-GSH 體系的pH 分別為1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12時對加入Hg2＋前后熒光強(qiáng)度及吸光度的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知:在不加Hg2＋時,在pH 5～12內(nèi),熒光強(qiáng)度和吸光度較低且沒有明顯變化;在pH 1～5內(nèi),Rh6G2-GSH 體系的熒光強(qiáng)度和吸光度均隨酸度的增加而增加,這是由于熒光探針Rh6G2-GSH中的螺酰胺環(huán)可在酸性條件下打開,使熒光強(qiáng)度和吸光度增大;在加入Hg2＋后,熒光強(qiáng)度和吸光度均顯著增強(qiáng),且在pH 1～12 范圍內(nèi)基本穩(wěn)定,說明Hg2＋能夠增強(qiáng)Rh6G2-GSH 體系的熒光強(qiáng)度和吸光度,且生成的產(chǎn)物不受體系酸度的影響。綜合考慮,試驗選擇的體系酸度為pH 7。

圖1 酸度對加入Hg2＋前后熒光強(qiáng)度及吸光度的影響Fig.1 Effect of acidity on fluorescence intensity and absorbance before and after adding Hg2＋

2.2 熒光探針Rh6G2-GSH 對Hg2＋的選擇性

在Rh6G2-GSH 體系中加入0.1 mol·L－1的Hg2＋以及同等濃度的Al3＋、Cd2＋、Co2＋、Cr3＋、Fe3＋、Cu2＋、K＋、Mn2＋、Na＋、Fe2＋、Mg2＋、Ca2＋、Zn2＋、Ag＋等常見金屬陽離子和空白(水),反應(yīng)24 h后,所得體系的熒光發(fā)射光譜和紫外-可見吸收光譜見圖2。

由圖2可知:Rh6G2-GSH 體系僅對Hg2＋有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度和吸光度,對其他14種金屬陽離子的響應(yīng)都較弱,表明探針對Hg2＋具有較高的選擇性。

圖2 Rh6G2-GSH 體系對不同金屬陽離子和空白的響應(yīng)結(jié)果Fig.2 Response of Rh6G2-GSH system to the different metal cations and blank

為了進(jìn)一步探究熒光探針Rh6G2-GSH 對Hg2＋的選擇性,在Rh6G2-GSH 體系中分別加入0.1 mol·L－1上述金屬陽離子溶液后,再加入0.1 mol·L－1Hg2＋,體系的熒光強(qiáng)度和吸光度變化見圖3。

由圖3可知:除了Cr3＋外,其他金屬陽離子對Hg2＋的熒光檢測結(jié)果均沒有干擾;除Cr3＋、Al3＋外,其他金屬陽離子基本對Hg2＋的紫外檢測結(jié)果沒有干擾。造成以上異?，F(xiàn)象的主要原因是Cr3＋和Al3＋為易水解離子,會引起體系酸度的改變[13],但當(dāng)樣品溶液中存在Al3＋時,可采用熒光分光光度法進(jìn)行測定,樣品溶液中存在Cr3＋時,應(yīng)采用適當(dāng)方法掩蔽或去除Cr3＋后,再采用熒光分光光度法進(jìn)行測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗方法測定標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以Hg2＋濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的熒光強(qiáng)度或吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為2.5×10－5～2.5×10－4mol·L－1和5.0×10－5～2.5×10－4mol·L－1,線性回歸方程分別為y＝1.014×106x－19.69 和y＝3.830×103x－0.140 4,相關(guān)系數(shù)分別為0.996 5,0.998 8。根據(jù)文獻(xiàn)[14-15],分別計算兩種方法的檢出限,所得結(jié)果分別為1.39×10－9mol·L－1和4.07×10－7mol·L－1。與熒光分光光度法相比,紫外-可見分光光度法的靈敏度較低,線性范圍也較窄,但是這種方法具有操作簡便、肉眼可視化等優(yōu)點,可作為熒光分光光度法的輔助方法。

將本工作中的熒光分光光度法的線性范圍、檢出限同文獻(xiàn)報道的相關(guān)方法進(jìn)行比對,結(jié)果見表1。其中TFP5、L1、GSNO＠Au NS、Phenanthroline和R6GHA 分別對應(yīng)熒光素硫代酰肼探針、羅丹明B衍生物熒光探針、金納米團(tuán)簇?zé)晒馓结?、菲啰啉類化合物探針和羅丹明6G 熒光探針。

由表1可以看出:和其他方法相比,本法的檢出限更低,線性范圍更寬。

表1 本方法和文獻(xiàn)方法的比對Tab.1 Comparison of this method and other methods reported in references

2.4 樣品分析

按照試驗方法分析水樣,未檢出Hg2＋。對水樣進(jìn)行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗,每個濃度水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),所得結(jié)果見表2。

由表2可知:熒光分光光度法所得的Hg2＋回收率為95.1%～120%,RSD 為0.46%～2.4%;紫外-可見分光光度法所得的回收率為94.8%～100%,RSD 為0.15%～3.4%。兩種方法的準(zhǔn)確度和精密度均較好,可用于實際水樣中Hg2＋的檢測。

表2 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

2.5 熒光檢測機(jī)理的探究

Hg2＋能促進(jìn)羅丹明6G 衍生物螺酰胺環(huán)的開環(huán),與水反應(yīng)后,生成的水解產(chǎn)物使體系的熒光增強(qiáng)[19]。為了探究Rh6G2-GSH 和Hg2＋識別過程的可逆性,在Rh6G2-GSH 與Hg2＋體系中加入過量的乙二胺四乙酸(EDTA)用于絡(luò)合Hg2＋,結(jié)果顯示:加入絡(luò)合劑后,體系的熒光強(qiáng)度沒有明顯變化,表明Rh6G2-GSH 和Hg2＋的識別過程不可逆。用四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀解析Rh6G2-GSH 與Hg2＋的反應(yīng)產(chǎn)物,所得結(jié)果見圖4。其中圖4(b)為該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其相關(guān)信息。

圖4 Rh6G2-GSH 與Hg2＋的反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜圖Fig.4 MS spectra of the reaction product of Rh6G2-GSH and Hg2＋

由圖4 可知:[M ＋H]＋的m/z理論值為415.20,觀測值為415.201 3,綜合判斷,認(rèn)為該產(chǎn)物為C26H27N2O3＋,推測此識別過程與水解有關(guān),推斷反應(yīng)機(jī)理如圖5所示。

本工作基于Hg2＋對熒光探針Rh6G2-GSH 的熒光增強(qiáng)作用,采用熒光分光光度法和紫外-可見分光光度法測定了水中Hg2＋的含量。結(jié)果顯示:Rh6G2-GSH 和Hg2＋發(fā)生了不可逆作用,并水解生成了熒光性能更穩(wěn)定的C26H27N2O3＋;這兩種方法的精密度和準(zhǔn)確度均較好,熒光分光光度法的檢出限更低、線性范圍更寬,受其他金屬陽離子干擾程度更小,而紫外-可見分光光度法操作簡單,能進(jìn)行肉眼可視化檢測,可作為熒光分光光度法的輔助方法,均可用于實際水樣中Hg2＋的測定。