呂 穩(wěn),李紅英,李麗霞,丁曉萍

(1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,武漢 430075;2.湖北省藥品質(zhì)量檢測與控制工程技術(shù)研究中心,武漢 430075)

化妝品由于基質(zhì)復(fù)雜、輔料繁多,又與人體皮膚直接接觸,常引起過敏反應(yīng),其主要過敏原有防腐劑、芳香混合物、重金屬、激素、中藥提取物等[1-2]。為減輕過敏反應(yīng),化妝品中有添加抗過敏藥物的風(fēng)險(xiǎn)。組胺是引起人體皮膚過敏反應(yīng)的主要化學(xué)物質(zhì),因此抗組胺類藥物是目前主要使用的抗敏劑。然而,長期使用抗組胺類藥物會(huì)引起多種不良反應(yīng),如嗜睡、變應(yīng)性接觸性皮炎、心臟毒性等,還會(huì)讓皮膚對其產(chǎn)生依賴性,停止使用后過敏癥狀加重,可能引起毛細(xì)管擴(kuò)張、色素沉著、內(nèi)分泌紊亂等不良反應(yīng)[3-5]。我國2015年版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》明確規(guī)定地氯雷他定等15種抗組胺類藥物為禁止添加物[6]。然而,隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷發(fā)展,抗組胺類藥物種類遠(yuǎn)不止15種,如多西拉敏、奧洛他定、曲普利啶、咪唑斯汀、非索非那定和酮替芬等6種常用的抗組胺類藥物[7-8]。為了進(jìn)一步完善相關(guān)監(jiān)督體系,凈化化妝品市場,應(yīng)擴(kuò)大抗組胺類藥物的檢測范圍。

目前關(guān)于抗組胺類藥物的檢測方法主要有液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[9-13],其檢測對象主要為藥物、保健食品,而關(guān)于化妝品中抗組胺類藥物的檢測研究較少,且研究對象主要集中在祛痘類、嬰幼兒等相關(guān)產(chǎn)品上[5,14-15]。面膜類產(chǎn)品因其良好的效果而得到廣泛使用,由于其與人體面部敏感皮膚直接接觸,且用液量大、接觸時(shí)間長,所以引起過敏的風(fēng)險(xiǎn)較高,因此有必要對其添加抗過敏類藥物的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估。相對于傳統(tǒng)液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)由于具有分析快速、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。因此,本工作采用UHPLCMS/MS同時(shí)測定化妝品中21種抗組胺類藥物(琥珀酸多西拉敏、富馬酸酮替芬、鹽酸曲吡那敏、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶、馬來酸溴苯那敏、鹽酸奧洛他定、鹽酸苯海拉明、阿司咪唑、地氯雷他定、鹽酸異丙嗪、鹽酸非索非那定、鹽酸賽庚啶、鹽酸羥嗪、咪唑斯汀、鹽酸西替利嗪、鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、特非那定、鹽酸氟奮乃靜、氯雷他定),同時(shí)對50批面膜中21種抗組胺類藥物進(jìn)行篩查,以期為化妝品中違禁使用的抗組胺藥物的分析提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters TQD 型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀;XP-204型電子天平;HMV-50A 型渦旋振蕩器;BRANSON 8800型超聲波清洗儀;Milli-Q A10型超純水器。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取21種抗組胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g,用甲醇溶解并定容于10 mL 棕色容量瓶中,配制成1.00 g·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取各目標(biāo)化合物的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0.5 mL于100 mL容量瓶中,用甲醇稀釋配制成5.0 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10,20,50,100,200,500μL至10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋配制成5,10,25,50,100,250μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

琥珀酸多西拉敏、富馬酸酮替芬、鹽酸曲吡那敏、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶、馬來酸溴苯那敏、鹽酸奧洛他定、鹽酸苯海拉明、阿司咪唑、地氯雷他定、鹽酸異丙嗪、鹽酸非索非那定、鹽酸賽庚啶、鹽酸羥嗪、咪唑斯汀、鹽酸西替利嗪、鹽酸氯丙嗪、奮乃靜、特非那定、鹽酸氟奮乃靜、氯雷他定等21種抗組胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99%;甲醇、甲酸和甲酸銨為色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱溫30 ℃;流量0.4 mL·min－1;流動(dòng)相:A 為含0.1 mol·L－1甲酸銨的0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為甲醇;進(jìn)樣量1μL。梯度洗脫程序:0～4 min時(shí),B為50%;4～14 min時(shí),B由50%升至100%,保持2 min;16～16.1 min時(shí),B由100%降至50%,保持4 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI＋)模式;去溶劑氣流量550 L·h－1;去溶劑溫度250 ℃;毛細(xì)管電壓3 000 V;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;為提高儀器靈敏度,采用分段采集模式:0～9 min,采集序號1～12的化合物;7～14 min,采集序號13～21的化合物(各序號對應(yīng)的化合物見表1)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

稱取0.1 g(精確到0.000 1 g)樣品于具塞比色管中,加入甲醇20 mL,渦旋振蕩30 s,使試樣與提取溶劑充分混勻。超聲提取20 min,用甲醇定容至25 mL,搖勻,若樣品溶液黏度較大,過濾困難,則以8 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min。取樣品溶液或上清液過0.22 μm 濾膜,濾液供UHPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件測定陰性樣品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液(加標(biāo)量為100μg·L－1),得到的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 陰性樣品溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of negative sample solution,mixed standard solution and spiked sample solution

由圖1可知:陰性樣品溶液的色譜圖中基本無雜峰,混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)樣品溶液的色譜圖基本一致,表明該方法的干擾較少,特異性較好;21種目標(biāo)化合物色譜分離較好,峰形尖銳對稱,15 min內(nèi)全部出峰,滿足試驗(yàn)分析要求。

2.2 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)考察了分別以甲醇、乙醇和乙腈等3種有機(jī)溶劑作為提取溶劑時(shí)的提取效果(以21種目標(biāo)化合物回收率的平均值表示)。結(jié)果顯示:以甲醇、乙醇和乙腈作提取溶劑時(shí),所得回收率分別為95.2%,89.7%,94.5%。其中,乙腈和甲醇的回收率相近,考慮到乙腈的毒性較大,試驗(yàn)選擇甲醇作為提取溶劑。

2.3 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了Waters Cortecs C18(150 mm×2.1 mm,2.7 μm)、Agilent Poroshell EC-C18(100 mm×2.1 mm,2.7μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH-C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)等3種色譜柱對21種目標(biāo)化合物分離效果和峰形的影響。結(jié)果顯示:3種色譜柱的分離效果有所差別,Waters Cortecs C18色譜柱分析時(shí)間較長,Agilent Poroshell EC-C18色譜柱的分離度優(yōu)于Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱的。綜合出峰時(shí)間、分離度和峰形等因素,試驗(yàn)選擇Waters ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

在電噴霧離子源下,對100μg·L－1的21種抗組胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行正離子和負(fù)離子掃描,結(jié)果顯示,21種目標(biāo)化合物均在ESI＋模式下獲得最佳準(zhǔn)分子離子峰。再采用二級質(zhì)譜掃描模式對準(zhǔn)分子峰進(jìn)行子離子掃描,優(yōu)化碰撞能量和錐孔電壓,選擇特征峰明顯、豐度較高的兩個(gè)子離子作為定性定量離子,其中響應(yīng)值較大且穩(wěn)定的一個(gè)子離子作為定量離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與測定下限

按照儀器工作條件測定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示:21種抗組胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為5～250μg·L－1,其他線性參數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(3S/N),以10倍信噪比計(jì)算方法的測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

由表2 可知:21 種抗組胺類藥物的檢出限為0.1～0.5μg·L－1,測定下限為0.2～1.5μg·L－1。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對水基、乳基和霜基等3種基質(zhì)的陰性樣品進(jìn)行2個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),所得精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3 (續(xù))

由表3可知:21種抗組胺類藥物在3種基質(zhì)中的回收率為80.2%～110%,RSD 為1.5%～7.9%,表明本方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足化妝品檢測的要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備陰性加標(biāo)樣品,加標(biāo)量分別為10,100μg·L－1,分別于0,3,6,9,12,24 h進(jìn)樣測定,計(jì)算各目標(biāo)化合物測定值的RSD。結(jié)果顯示:21種抗組胺類藥物測定值的RSD 均小于4.8%,表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析50 批面膜樣品,均未檢出21種目標(biāo)抗組胺類藥物,表明所選擇的產(chǎn)品質(zhì)量狀況良好。

本工作建立了UHPLC-MS/MS同時(shí)測定化妝品中21種抗組胺類藥物含量的方法,該方法可以在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)21種抗組胺類藥物的篩查,適用于水、乳和霜類等多種基質(zhì)樣品分析。本方法定性定量準(zhǔn)確、操作簡單、準(zhǔn)確度高、精密度好、檢出限低,可以滿足化妝品中非法添加抗組胺類藥物的多組分快速檢測,能為監(jiān)管化妝品非法添加提供有力的技術(shù)支持。