胡 楊，劉昌燕，廖芳麗，李 莉，陳宏偉，劉良軍，韓雪松，萬正煌*，盧碧林，沙愛華*

(1.長江大學農(nóng)學院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心/濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北 荊州 434025；2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064； 3. 荊州市種子管理局，湖北 荊州 434020)

【研究意義】蠶豆(ViciafabaL.)屬蝶形花科野生豌豆屬，營養(yǎng)豐富并具固氮特性，能增加土壤氮素，緩解地力養(yǎng)分的消耗[1]。隨著環(huán)境條件的不斷變化，干旱等非生物脅迫逐漸成為影響農(nóng)作物生長的限制因子，干旱造成的經(jīng)濟損失在眾多非生物脅迫中居首位[2]。種子萌發(fā)是植物生長的起始階段，土壤水分影響種子萌發(fā)，決定植物是否能夠獲得足夠苗數(shù)，以保證獲得足夠的生物產(chǎn)量。蠶豆種子萌發(fā)需水較多，播種后如果干旱少雨，將導致種子萌發(fā)力下降，出苗少，蠶豆產(chǎn)量最終會受到影響[3]。自噬(Autophagy，ATG)是真核細胞面臨營養(yǎng)缺乏時，在溶腔、液泡或溶酶體中降解大量細胞成分的系統(tǒng)[4]。在植物中，自噬作用響應各種環(huán)境脅迫，如養(yǎng)分缺乏、干旱、鹽堿和高溫，表明其具備用于提高作物應對環(huán)境脅迫的潛力[5]。因此，從蠶豆中鑒定自噬基因，分析其在種子萌發(fā)過程中對干旱脅迫的響應，將有利于鑒定出特定的自噬基因，用于改良蠶豆種子萌發(fā)耐旱能力，為培育高產(chǎn)耐旱蠶豆品種奠定基礎?！颈狙芯壳腥朦c】根據(jù)蠶豆轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，鑒定蠶豆中ATG基因，并進行全面的生物信息學分析。【前人研究進展】ATG基因廣泛存在于動物、植物、微生物中。許多ATG基因在動植物中功能保守[6]。目前，在酵母中已經(jīng)鑒定出32個ATG基因[7]，在擬南芥、水稻、馬鈴薯、辣椒、玉米中分別鑒定出了32、40、33、29、42個ATG基因[8-12]。其中一部分ATG蛋白的功能已得到驗證。如過表達OsATG8c顯著增加自噬活性，株高降低，有效分蘗和產(chǎn)量增加[13]；番茄ATG18的激活提高番茄植株耐旱性，在干旱脅迫下降解泛素化蛋白質(zhì)聚集體促進植株存活[14]；過表達辣椒CaATG6提升了辣椒的耐熱性[15]。自噬在植物生長發(fā)育過程中表達水平低，但在干旱等非生物脅迫下通過上調(diào)自噬水平幫助植物存活[16]。ATG基因過量表達增強自噬，能夠提高植物產(chǎn)量和氮素轉(zhuǎn)運效率[17-18]。但缺乏自噬會導致葉片過早衰老，并降低植物種子產(chǎn)量和質(zhì)量[19]。在甘露醇誘導的滲透脅迫下，擬南芥ATG8家族中9個基因都有不同程度的上調(diào)表達，且滲透脅迫誘導的表達高于鹽脅迫[20]。此外，滲透脅迫也誘導AtATG18a上調(diào)表達激活自噬[21]。在蘋果中，自噬相關基因MdATG18a激活自噬基因ATG31提高了對病毒和干旱脅迫的抗性[22]?！緮M解決關鍵問題】利用生物信息學方法鑒定蠶豆ATG基因家族，并分析其基因結構、亞細胞定位、蛋白保守結構域、系統(tǒng)進化發(fā)育、對干旱脅迫的響應，為進一步研究蠶豆ATG基因生物學功能，應用ATG基因提高蠶豆品種耐旱性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蠶豆(ViciafabaL.)品種為埃塞俄比亞品種CDAS105和湖北品種鄂蠶1號，由湖北省農(nóng)業(yè)科學院雜糧研究工程中心提供。主要試劑：RNA提取試劑盒(廣東健侖生物科技有限公司)、甘露醇(天津市科密歐化學試劑科技有限公司)。

1.2 樣品采集、RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

試驗在長江大學農(nóng)學院耐漬油料種質(zhì)資源湖北省重點實驗室進行。于2019年7月選取形態(tài)大小均等的耐旱品種CDAS105和干旱敏感品種鄂蠶1號種子，分別放入濃度為0.8 %的甘露醇和滅菌蒸餾水的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫箱中萌發(fā)，萌發(fā)后16和64 h切取含胚芽的1/4部分子葉，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于提取RNA。每個處理設置3個生物學重復。轉(zhuǎn)錄組測序由武漢古奧科技有限公司完成。

1.3 基因注釋及ATG基因篩選

以蠶豆轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎，根據(jù)Swiss-prot數(shù)據(jù)庫中注釋為ATG基因，用TBtools軟件[23]提取相應的蛋白序列后，在NCBI進行Blast，同時利用SMART在線軟件(https:/smart.embl-heidelberg.de/)對序列的保守結構域進行預測，去除非ATG編碼序列、重復序列及冗余轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)[24]描述方法，對篩選出的蠶豆ATG基因進行分類和命名。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載酵母ATG蛋白序列后，并與在EnsemblPlants(http://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中下載獲得玉米、水稻、擬南芥ATG蛋白序列利用MEGA-X軟件的ClustalW程序?qū)πQ豆及擬南芥、玉米、水稻、酵母ATG蛋白進行多序列比對，采用NJ法(Neighbor Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過Bootstrapmethod (BM)模型算法進行估計，并進行Bootstrap分析，重復值設置為1000。利用在線程序iTOL(https://itol.embl.de/)美化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 生物信息學分析

蠶豆ATG基因結構通過TBtools軟件進行可視化分析。亞細胞定位利用在線軟件ProtComp9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 預測。蛋白理化性質(zhì)通過在線軟件ExPASy-ProtParam tool分析；保守基序(motif)類型和排列順序軟件為MEME(http://meme-suite.org/)。蛋白結構域通過SMART軟件分析。

1.6 ATG響應干旱脅迫表達分析

蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測序文庫中基因片段表達量采用FPKM (fragments per kilobase million) 計算。將數(shù)據(jù)標準化后，利用TBtools軟件構建ATG在2個品種中不同處理時間的表達熱圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel2010進行整理及制圖。

2 結果與分析

2.1 蠶豆ATG基因家族的鑒定及分類

基于干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，根據(jù)Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫中的注釋，初步篩選到117個ATG相關基因。進一步通過NCBI BlastP比對和保守結構域預測，最終得到12個ATG基因。通過與酵母ATG進行比對，將它們分為5個基因亞族，分別為ATG3基因(VfAG3)，ATG6基因(VfATG6)，ATG8基因(VfATG8a、VfATG8b、VfATG8c、VfATG8d、VfATG8e、VfATG8f)；ATG18基因(VfATG18a、VfATG18b、VfATG18c)和ATG26(VfATG26)基因(圖1)。

2.2 Vf ATG蛋白的進化分析

將蠶豆中鑒定的12個ATG與酵母、擬南芥、玉米、水稻中的ATG蛋白進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)蠶豆的ATG分別與其他物種中對應的亞家族蛋白聚在同一分枝上，如VfATG3與擬南芥AtATG3、酵母ScATG3、玉米ZmATG3、水稻OsATG3位于同一個分枝上；VfATG8與ScATG8、AtATG8、ZmATG8、OsATG8 (abcdef)位于同一亞枝上；VfATG18、ScATG18、AtATG18、ZmATG18、OsATG18(abc)位于同一亞枝上(圖2)。表明蠶豆中新鑒定這些蛋白與其他物種中同一亞家族蛋白結構和功能域相似。

2.3 蠶豆ATG蛋白的理化性質(zhì)及亞細胞定位預測

蠶豆中鑒定的12個ATG蛋白的長度為118～623 aa，預測的蛋白分子量(Mr)大小為13 625.6～68 506.87(表1)。等電點(PI)4.8～9.06，其中VfATG8a、VfATG8b、VfATG8d、VfATG8e、VfATG8f、VfATG18c為堿性蛋白(PI為7.99～9.03)，其他6個為中性蛋白(PI為4.8～7.0)。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)除VfATG8f和VfATG18b小于40外，其他蛋白均大于40，表明鑒定的大部分蠶豆ATG屬于不穩(wěn)定蛋白。12個蠶豆ATG平均親水系數(shù)均為負值，表明其都是親水蛋白。亞細胞定位預測除VfATG3位于細胞質(zhì)，其余均位于細胞核外表明鑒定的蠶豆ATG蛋白可能主要參與細胞核外一些特定的生物學過程。

表1 VfATG理化性質(zhì)及亞細胞定位預測

2.4 蠶豆ATG基因結構、蛋白結構域和保守基序分析

VfATG基因結構分析發(fā)現(xiàn)，VfATG基因家族成員無內(nèi)含子結構，每個成員都含有UTR區(qū)與CDS區(qū)，同一亞族成員基因編碼區(qū)長度大致相同(圖3-A)。蛋白結構域分析顯示，ATG3含有Autophagy_N、Autophagy_act_C和Autophagy_C 3個結構域，ATG6含有APG6、APG6_N 2個結構域其他蛋白都只含有1個結構域(圖3-B)。不同亞家族擁有不同的結構域，但同一亞家族的結構域基本保守，如ATG18、ATG8(圖3-B)。進一步分析ATG蛋白中的保守基序發(fā)現(xiàn)，VfATG蛋白中共鑒定出20個motif(mortif 1-mortif 20))，其長度為6～50個氨基酸(圖3-C，表2)。在預測的20個motif中，motif 1第33～40位氨基酸具有保守性(3-D)，motif 2第33～39位氨基酸也相對保守，motif 8中除了第5位氨基酸以外，其他位點氨基酸相對保守。ATG6擁有最多基序(motif 6，9，12，15，16，17，18，19)，其次是ATG26(mortif 10，12，14，16，18，20)和ATG18(mortif 3，4，5，8，9，13，15)(圖3-C)。不同亞家族含有的mortif各不相同，但同一亞家族蛋白之間具有相似的mortif，如ATG8 和ATG18(圖3-C)。

2.5 VfATG響應干旱脅迫表達分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結果，分別提取鑒定的12個ATG的表達繪制熱圖(圖4)。在干旱處理16 h后，ATG18b和ATG18c在抗旱品種CDAS105(T2)中較敏感品種鄂蠶1號(T1)表達上調(diào)，而ATG8c表達下調(diào)。在干旱處理64 h后，ATG8a在抗旱品種中較敏感品種表達上調(diào)。而在對照處理中，ATG8b和ATG8c分別在處理16 h的抗旱品種中上調(diào)表達和下調(diào)表達，ATG8a則在處理后64 h抗旱品種中上調(diào)表達。表明干旱處理16 h后，ATG18b和ATG18c迅速上調(diào)表達可能與CDAS105的抗旱性相關；而ATG8b在對照處理中上調(diào)表達，以及ATG8c在干旱和對照處理中均下調(diào)表達，可能是由于品種的生理特性差異決定的，與品種抗旱性差異關系不大。ATG8a在抗旱品種中干旱和對照處理64 h后均上調(diào)表達，表明其可能在抗旱品種中本底表達較高，從而導致抗旱品種的抗旱性更強。同時通過比較ATG基因在同一品種干旱處理不同時間表達發(fā)現(xiàn)，ATG8a在T2中干旱處理64 h較16 h表達上調(diào)，而ATG8e在干旱處理64 h后，在T2和T1中均較處理16 h表達上調(diào)。表明隨著干旱處理時間的增加，ATG8a在T2中表達進一步增強，從而更有利于增強其抗旱性。而ATG8e在抗旱品種和敏感品種中均隨著干旱處理時間的增加表達增強，表明其可能參與干旱脅迫的基礎防衛(wèi)反應，與品種的抗旱性差異關系不大。

表2 VfATG蛋白結構域在肽鏈中的位置

3 討 論

自噬基因響應養(yǎng)分缺乏、干旱、鹽堿和高溫等各種環(huán)境脅迫，可用于改良作物的抗逆性。盡管在擬南芥、水稻、玉米等植物中鑒定了一些ATG基因，但在蠶豆中還未見報道。

本文根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結果，結合生物信息學分析，首次從蠶豆中鑒定了12個ATG基因。通過分析這些基因?qū)Ω珊得{迫的響應，鑒定出ATG8a、ATG18b和ATG18c在蠶豆抗旱品種和敏感品種中存在表達差異，表明這些基因可能參與蠶豆種子萌發(fā)過程中的干旱脅迫調(diào)控。前人研究也發(fā)現(xiàn)，ATG8、ATG18家族成員在擬南芥[17-19，22，24，26]、番茄[12]、蘋果[19]、水稻[27]中參與滲透或干旱脅迫調(diào)控。表明ATG8和ATG18基因家族成員在不同物種中具備調(diào)控干旱脅迫的功能保守性。因此，本文從蠶豆中鑒定的ATG8a、ATG18b和ATG18c可以作為潛在的基因資源，用于改良蠶豆種子萌發(fā)的耐旱能力，進一步應用于培育高產(chǎn)耐旱蠶豆品種。

此外，本文鑒定的12個蠶豆ATG基因分布于ATG3、ATG6、ATG8、ATG18和ATG26這5個亞基因家族，聚類分析中分別與水稻、玉米中的相應亞家族成員位于同一分枝。一般情況下，同一分枝上的亞家族蛋白具有相似的結構和功能域，因此功能也趨于保守。蘋果中MdATG3a和MdATG3b響應葉片衰老、氮饑餓、干旱、鹽和氧化脅迫，在擬南芥中過量表達MdATG3a和MdATG3b均增強滲透和鹽脅迫耐性，并改善植物生長[24]。擬南芥中ATG6為花粉萌發(fā)和生長發(fā)育所必需[29]，水稻中ATG6響應熱、冷和干旱脅迫[28]，過表達辣椒CaATG6提升了辣椒的耐熱性[30]。擬南芥中過量表達ATG8提高N素重新移動效率和促進籽粒充實[31]。擬南芥中過量表達甜橙CsATG18a和CsATG18b，提高了轉(zhuǎn)基因植物對滲透脅迫、鹽、干旱和凍害的耐受性[32]。因此，蠶豆中鑒定的12個ATG除了ATG8a、ATG18b和ATG18c參與抗旱脅迫響應外，包括這3個基因在內(nèi)的其他ATG可能還參與調(diào)控生長發(fā)育或其他環(huán)境脅迫反應，其生物學功能還有待于進一步鑒定，以期能充分利用這些基因改良蠶豆的相關性狀，提高蠶豆生產(chǎn)的效益。

4 結 論

基于蠶豆干旱脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，鑒定了12個蠶豆ATG基因，明確了其進化關系、基因結構、亞細胞定位、理化性質(zhì)等，并篩選出VfATG8a、VfATG18b和VfATG18c響應蠶豆干旱脅迫，能夠用于改良蠶豆種子萌發(fā)的耐旱性。