王巍然，林祥龍，趙龍，張家樂，樊文華*，侯紅*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山西 太谷030801；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點實驗室，北京100012；3.陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，西安710000）

鋅（Zn）是較為常見的一種重金屬，其在現(xiàn)代工業(yè)中被普遍使用在電池制造、電鍍等領(lǐng)域。Zn在生物的生命活動中起著極其重要的作用，是許多生物必需的微量元素之一。但過量的Zn對生物有一定危害，長期接觸或攝入大量的Zn可引發(fā)慢性中毒[1]。隨著城市化進(jìn)程的加快以及采礦冶煉、污泥傾倒、電子廢棄物拆解等人類工業(yè)化活動的加劇，重金屬嚴(yán)重污染環(huán)境的狀況愈發(fā)嚴(yán)峻。Zn已被列為8種重金屬污染物之一，其點位超標(biāo)率為0.9%，是我國常見的工業(yè)污染物。

建立重金屬毒性閾值預(yù)測模型的關(guān)鍵在于探究不同土壤理化性質(zhì)對重金屬毒性閾值的影響。研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)質(zhì)含量、土壤酸堿度、土壤粒度和晶質(zhì)/非晶質(zhì)鐵錳鋁等均是影響重金屬毒性閾值常見的關(guān)鍵因子[2]。有學(xué)者[3-5]對我國不同土壤中Zn 對植物（大麥、西紅柿和小白菜）、無脊椎動物（Opisthopora 蚯蚓）和微生物（基質(zhì)誘導(dǎo)硝化）毒性閾值進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)土壤理化性質(zhì)是影響Zn毒性閾值的關(guān)鍵因素。一些外國學(xué)者開展了關(guān)于Zn 對土壤跳蟲毒性閾值的研究[6-9]，發(fā)現(xiàn)不同類型土壤中有機(jī)質(zhì)含量差異和礦物類型理化性質(zhì)的差異對Zn毒性閾值影響很大。

跳蟲是土壤中的優(yōu)勢物種。作為一種典型的土壤無脊椎動物，跳蟲具有品種極豐富、數(shù)量極龐大、分布極廣泛等特點，是土壤中分解有機(jī)質(zhì)、促進(jìn)營養(yǎng)循環(huán)的重要一環(huán)[10-11]。白符跳（Folsomia candida）作為跳蟲的一種，其繁殖快、生長周期短，在污染土壤中的暴露途徑可指示土壤環(huán)境的質(zhì)量，是重要的指示性生物之一，已被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）規(guī)定為毒性實驗的模式生物[12]。白符跳蟲對土壤中的毒害物質(zhì)敏感性很高，如白符跳對某些化學(xué)污染物的敏感度是奇跳的10 倍[13]。Buch 等[14]研究發(fā)現(xiàn)土壤外源添加重金屬汞對白符跳繁殖的EC50值為3.32 mg·kg-1，而影響節(jié)跳（Proisotoma minuta）繁殖的EC50值為4.43 mg·kg-1。

目前國內(nèi)有關(guān)Zn 對跳蟲毒性閾值的研究尚未見報道。本研究以ISO 標(biāo)準(zhǔn)方法指南[12]為指導(dǎo)，選用我國20 種具有一定代表性的土壤作為供試土壤，選取白符跳蟲個體水平的死亡率和繁殖數(shù)量為試驗終點，以外源添加不同濃度Zn作為染毒方式，研究白符跳的毒性閾值，并建立基于土壤理化性質(zhì)的毒性預(yù)測模型。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤為全國范圍內(nèi)20 種理化性質(zhì)各異的土壤（0～20 cm），采集的土壤經(jīng)室內(nèi)自然風(fēng)干、剔除植物根系及石塊后，分別過篩，以滿足測試?yán)砘再|(zhì)的不同粒徑。土壤pH的測定參照NY/T 1377—2007：風(fēng)干土壤過2 mm 篩，采用土水比1∶2.5 電位法測定；土壤有機(jī)質(zhì)含量：風(fēng)干土過100 目篩，采用重鉻酸鉀容量法測定[15]；w（CaCO3）：風(fēng)干土過0.25mm 篩，采用中和滴 定 法 測 定[15]；w（Fe總）、w（Mn總）、w（Al總）和w（Zn背景）：經(jīng)濕式消解法（HCl-HNO3-HF-H2O2）前處理后測定；w（Fe非晶質(zhì)）、w（Mn非晶質(zhì)）和w（Al非晶質(zhì)）：風(fēng)干土過0.25 mm 篩，采用草酸-草酸銨浸提-氟化鉀取代EDTA 容量法測定[15]；陽離子交換量（CEC）：風(fēng)干土過2 mm 篩，采用三氯化六氨合鈷浸提－分光光度法測定[16]；土壤中w（黏粒）：風(fēng)干土過1 mm篩孔，采用吸管法測定[17]。w（Zn背景）范圍為60.21～109.26 mg·kg-1，20種受試土壤均不受Zn 的污染；土壤pH 變化范圍為3.30～8.89，w（OM）為4.31～65.73 g·kg-1，w（Fe非晶質(zhì)）、w（Mn非晶質(zhì)）和w（Al非晶質(zhì)）差異較大。20 種受試土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

1.2 供試白符跳

白符跳蟲需要在進(jìn)行毒性試驗的實驗室中持續(xù)不斷地培養(yǎng)和使用，以保證供試生物狀態(tài)的穩(wěn)定。白符跳在特制的80 mm×13 mm 透明培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其底部填充厚度為0.3～0.5 cm 的培養(yǎng)基（凝固的活性炭與石膏，配比為1∶9）。添加活性炭的作用是吸收廢氣和部分排泄物，同時便于在黑色的背景下觀察淺色的跳蟲個體。此外，制作好的培養(yǎng)基的表面用刀劃上刻痕，以便于成年跳蟲產(chǎn)卵[11]。適量添加干酵母粒（購自安琪公司）作為白符跳的食物。跳蟲培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，故使用人工氣候箱（寧波賽福實驗儀器-智能生化培養(yǎng)箱SPX-450）控制，雖然跳蟲不具備感受光照的外部器官，但是研究表明在跳蟲內(nèi)部具有光感受器[3]，故設(shè)置16 h∶8 h 光暗循環(huán)（光照強(qiáng)度400～800 lx）。氣候箱濕度控制在75%左右，每隔3 d 為培養(yǎng)基補(bǔ)充適量去離子水保持培養(yǎng)基表面濕潤適宜跳蟲生存，同時每隔1～2 d 補(bǔ)充適量食物。在培養(yǎng)過程中及時清除培養(yǎng)基表面雜質(zhì)，保持培養(yǎng)基表面處于清潔且濕潤的狀態(tài)。培養(yǎng)期間每隔2 個月更換一次培養(yǎng)基，以利于白符跳蟲產(chǎn)卵繁殖。

表1 20種受試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 The basic physicochemical properties of tested soils

1.3 供試白符跳同齡化培養(yǎng)

正式的毒性試驗需避免白符跳蟲齡差異和個體大小差異對試驗的干擾。跳蟲的同齡化培養(yǎng)[18]：將適當(dāng)大小且較活躍的白符跳成蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿，加入少量干酵母，培養(yǎng)條件同1.2。經(jīng)過2～3 d 后，觀察到白符跳在新制培養(yǎng)基表面產(chǎn)卵并有幼蟲孵化出后，添加少量食物，待幼蟲數(shù)量較多時移走成蟲，繼續(xù)培養(yǎng)7～9 d，得到可用于正式毒理試驗的10～12 d的白符跳，這些跳蟲即可認(rèn)定為是同齡化后個體大小差異較小，年齡相同的跳蟲個體。

1.4 土壤外源Zn添加

土壤中外源Zn 以ZnCl2水溶液噴施的方式添加，w（Zn外源）濃度設(shè)置為100、200、400、800、1 600、3 200 mg·kg-1，空白對照組只添加去離子水，每個處理用土200 g。土壤與ZnCl2水溶液充分混勻后，將土壤水分調(diào)節(jié)到最大可持水量的55%～60%，然后將土壤置于半封口狀態(tài)的自封袋中穩(wěn)定7 d，期間通過稱質(zhì)量的方法添加去離子水以保持土壤濕度的穩(wěn)定。

1.5 白符跳毒性試驗

稱取25～30 g 外源添加Zn 后的濕潤土壤，向其中加入10只同齡化培養(yǎng)后的白符跳蟲和適量干酵母，旋緊上蓋后培養(yǎng)28 d，培養(yǎng)條件同1.2。由于前期跳蟲個體較小，攝食量低且密閉恒溫環(huán)境中容易導(dǎo)致食物發(fā)霉，故第1～2 周添加的食物量較少，之后每2 d 添加1次食物，添加量視Zn濃度增加而遞減。并通過稱質(zhì)量的方法補(bǔ)充少量去離子水以維持土壤濕度。經(jīng)過28 d培養(yǎng)試驗后，將有機(jī)玻璃杯中所有內(nèi)容物傾倒于250 mL 的燒杯中，并在燒杯中加入150 mL 自來水和幾滴黑藍(lán)色墨水（白符跳蟲體色偏淺色，當(dāng)土壤溶液顏色較淺時不易區(qū)分觀察），用玻璃棒由下至上翻攪土壤懸濁液，由于存活的白符跳個體表面會分泌油脂類物質(zhì)，使其可以漂浮于水面之上，所以攪拌后靜置1～2 min，待存活成蟲和幼蟲浮到水面后拍照保存，并對數(shù)碼照片編號，利用Image J軟件[19]對白符跳存活和繁殖數(shù)量進(jìn)行計數(shù)。

1.6 土壤中有效態(tài)鋅的測定

w（ZnCa）表示利用CaCl2溶液提取的有效態(tài)Zn 含量，分析測定方法參考Bur 等[20]，稱?。?.000±0.005）g過0.25 mm 篩的土壤樣品于50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 0.01 mol·L-1的CaCl2溶液，恒溫水浴振蕩器（豪誠實驗儀器SHZ-28A）水浴振蕩2 h 后（25 ℃，200 r·min-1），使用離心機(jī)（湘儀TDZ5-WS）離心10 min（3 000 r·min-1）。將上清液用一次性注射器吸出并通過醋酸纖維濾膜（0.45 μm）過濾后，稀硝酸稀釋，采用ICP-MS（安捷倫科技有限公司Agilent 7500cx）測定濾液中w（ZnCa）。

w（Zn總）表示利用消解土壤的方式測定的Zn 總量：參考王北洪等[21]的方法，用電子天平準(zhǔn)確稱取土壤樣品0.150 0 g，置于密封高壓消解罐中。向其中加入5 mL 硝酸、2 mL 過氧化氫、2 mL 氫氟酸，搖勻。將消解罐安裝好，放入烘箱中，在150～160 ℃下密閉消解平衡9 h，樣品消解完成之后，待消解罐溫度降至室溫時開啟。將內(nèi)罐取出，利用電熱板趕酸。趕酸完畢后用0.5%硝酸溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 刻度試管中，靜置待溶液澄清后采用ICP-MS（安捷倫科技有限公司Agilent 7500cx）測定溶液中w（Zn總），采用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW-07427）作為試驗過程中的質(zhì)控。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

Zn對白符跳繁殖的EC50的推導(dǎo)公式：

式中：y為各個不同處理濃度所對應(yīng)的繁殖數(shù)量，只；x為測得的Zn總量或有效態(tài)Zn含量，mg·kg-1；a為對照組中繁殖的白符跳幼蟲數(shù)量；x0為EC50值，mg·kg-1；b為方程擬合過程中所產(chǎn)生的斜率參數(shù)。

Zn對白符跳存活的LC50的推導(dǎo)公式：

式中：y 為各個不同處理濃度所對應(yīng)的成蟲存活數(shù)量，只；x為測得的Zn總量或有效態(tài)Zn含量，mg·kg-1；c 為對照組中白符跳蟲成蟲存活數(shù)量；x1為LC50值，mg·kg-1；d為方程擬合過程中所產(chǎn)生的斜率參數(shù)。

方程的擬合利用SigmaPlot 軟件進(jìn)行，不同土壤理化性質(zhì)與Zn毒性閾值間的相關(guān)關(guān)系利用皮爾遜相關(guān)性分析確定，相關(guān)性分析利用IBM SPSS Statistics 26軟件確定?；谕寥览砘再|(zhì)的Zn對白符跳毒性閾值的毒性預(yù)測模型利用多元逐步回歸分析方法建立，采用OriginPro 2019 和Excel 2019 軟件進(jìn)行所有的圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn對白符跳毒性效應(yīng)和閾值的差異

對試驗后存活成蟲數(shù)量的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，多數(shù)土壤中白符跳成蟲存活數(shù)量無顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，且未出現(xiàn)隨w（Zn總）升高而減少的現(xiàn)象，僅有江西紅壤、安徽黃棕壤、江蘇水稻土、海南磚紅壤等酸性土壤在最高添加濃度附近白符跳成蟲的存活與對照組相比受到顯著影響。雖然在培養(yǎng)28 d 后白符跳成蟲的整體存活率超過60%，但是由于數(shù)據(jù)之間變異性較大，且成蟲存活數(shù)量無明顯變化規(guī)律，未呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其結(jié)果在此不作展示。

不同土壤中Zn 對白符跳毒性效應(yīng)差異見圖1。計算得出基于w（Zn外源）實測值推導(dǎo)的Zn 對白符跳繁殖的EC50值的變化為56～711 mg·kg-1，最大值為最小值的12.5 倍（表2）。對比不同土壤中Zn 對白符跳毒性效應(yīng)差異發(fā)現(xiàn)：當(dāng)土壤中w（Zn外源）為0～200 mg·kg-1時，山東潮土、陜西壚土、吉林黑土以及寧夏灰鈣土中白符跳的繁殖未受到外源添加Zn 的明顯影響，但其余土壤中白符跳繁殖數(shù)已經(jīng)開始減少；當(dāng)土壤中w（Zn外源）為200～800 mg·kg-1時，20 種土壤中幼蟲繁殖數(shù)量出現(xiàn)了不同的下降趨勢：新疆灰漠土、山西栗鈣土、吉林黑土以及湖北水稻土這4種土壤在不同Zn濃度之間白符跳繁殖數(shù)量變化幅度較?。欢不拯S棕壤、江西紅壤以及海南磚紅壤這3 種土壤中白符跳幼蟲數(shù)量急劇下降，數(shù)量變化非常明顯。當(dāng)土壤中w（Zn外源）繼續(xù)增大至1 600～3 200 mg·kg-1時，幾乎所有種類的土壤中白符跳幼蟲數(shù)量較上一個濃度范圍顯著減少，在w（Zn外源）達(dá)到3 200 mg·kg-1時，所有土壤中白符跳幼蟲數(shù)量均減少至個位數(shù)，且存活的幼蟲出現(xiàn)應(yīng)激性減弱、活性差等生理活動表現(xiàn)。整體而言，經(jīng)過28 d 的毒性試驗后，20 種土壤中白符跳繁殖的幼蟲數(shù)量與外源添加Zn的總量之間雖變化趨勢不同，但具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。初步推測產(chǎn)生的不同變化趨勢主要與土壤之間的不同理化性質(zhì)相關(guān)。

2.2 基于土壤理化性質(zhì)的Zn 對白符跳繁殖的EC50的預(yù)測模型

將表2推導(dǎo)的EC50值與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Zn對白符跳繁殖的毒性閾值與土壤pH、非晶質(zhì)鋁兩種土壤理化性質(zhì)均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.819（P<0.01）、0.470（P<0.05）。相關(guān)性分析也表明除這兩種土壤理化性質(zhì)外，基于w（Zn總）推導(dǎo)的EC50值與其他理化性質(zhì)間的相關(guān)性均未達(dá)到顯著水平?；诖?，利用回歸分析建立毒性預(yù)測模型，在單一因子的模型構(gòu)建過程中土壤pH 是影響Zn對白符跳繁殖的EC50的最重要的單一因子，解釋了不同土壤之間EC50值65%的差異。為了提高該模型的預(yù)測能力，將w（有機(jī)質(zhì)）加入預(yù)測模型，結(jié)果表明預(yù)測模型的預(yù)測能力明顯提高，兩者可解釋Zn 對白符跳繁殖的EC50值90.5%的差異。在構(gòu)建毒性預(yù)測模型的過程中也嘗試將非晶質(zhì)鋁這一因子引入，但是在建立回歸方程時發(fā)現(xiàn)非晶質(zhì)鋁并不能更好地對不同土壤之間EC50值進(jìn)行解釋?；趙（Zn總）推導(dǎo)的EC50值與模型預(yù)測的EC50值之間相關(guān)性R2達(dá)到了0.935（圖2）。

3 討論

污染物對生態(tài)受體的毒性閾值大小與選取的評價終點有關(guān)[22]。不同評價終點對毒性閾值的影響十分顯著。繁殖和存活是生命體生物周期里最重要的兩個環(huán)節(jié)，故而很多針對白符跳毒理的研究都以存活率和繁殖率作為有效的評價指標(biāo)[12]。本研究中存活率不能作為評估Zn 對白符跳毒性的終點，土壤Zn 對白符跳繁殖這一測試終點的影響遠(yuǎn)比存活更加靈敏。白符跳遭遇到外界毒性脅迫后會優(yōu)先適應(yīng)惡劣環(huán)境，維持自身的存活，在這種情況下不會進(jìn)行產(chǎn)卵等生命活動[23]。也可能是由于成蟲彈跳性較強(qiáng)，對重金屬污染物有本能的趨避效應(yīng)，在培養(yǎng)期間也觀察到有個別成蟲爬至玻璃器皿的壁上以躲避毒性脅迫。而繁殖率的高敏感性可能與重金屬污染物更容易侵入白符跳產(chǎn)在土壤中的蟲卵，使得蟲卵的正常繁殖受到金屬毒性的影響有關(guān)[24]。

研究發(fā)現(xiàn)，土壤中Zn 的生物有效性受一系列物理化學(xué)性質(zhì)的控制[25]，而Zn 的生物有效性在通常情況下主要與溶液中可交換態(tài)Zn 的含量直接相關(guān)[26]。因此Zn 對白符跳繁殖的EC50值的差異與不同土壤中w（ZnCa）有關(guān)。陜西壚土、山東潮土、寧夏灰鈣土等偏砂質(zhì)土壤以及一些中性偏堿性土壤中w（ZnCa）較低，而江西紅壤、安徽黃棕壤、海南磚紅壤是最具代表性的酸性土壤，且均為粉質(zhì)偏黏土壤，其w（ZnCa）較高（圖3）；白符跳蟲是典型的土壤動物，其一系列生命活動均與土壤緊密相關(guān)，白符跳的攝食行為處在土壤表層，這不可避免地會通過皮層接觸土壤孔隙溶液，此外維持跳蟲正常生命活性的水分吸收過程也與土壤溶液緊密相關(guān)，兩者皆是白符跳非常重要的毒性暴露過程[27]。在20 種土壤中，根據(jù)w（ZnCa）得出的EC50值較由w（Zn總）得出的EC50值的差異有所減?。ū?），表明有效態(tài)Zn 能對不同土壤中Zn 對白符跳繁殖的毒性閾值有更好的解釋能力。這與Lock 等[27]和Smit等[28]有關(guān)Zn 對白符跳毒性閾值的研究結(jié)論相似。同樣在對其他金屬的毒性閾值研究中也發(fā)現(xiàn)，提取的有效態(tài)重金屬能解釋部分不同土壤中EC50值的差異：如Lin 等[29]發(fā)現(xiàn)，水提態(tài)As 和Ni 可以解釋部分不同土壤對白符跳繁殖的EC50的差異；李星等[30]發(fā)現(xiàn)，利用CaCl2提取Cu 的有效態(tài)可較好地預(yù)測和解釋Cu對白符跳繁殖EC50值的差異。

表2 基于w（Zn 總）和w（ZnCa）實測值推導(dǎo)的Zn對白符跳繁殖的EC50值Table 2 The EC50 values of Zn for the reproduction of Folsomia candida based on measured total Zn and CaCl2-extracted Zn

表3 基于土壤理化性質(zhì)建立的Zn對白符跳繁殖的EC50的預(yù)測模型Table 3 The predicting model of EC50 of Zn for the reproduction of Folsomia candida based on soil properties

本研究構(gòu)建的毒性預(yù)測模型中，除非晶質(zhì)鋁、pH、w（有機(jī)質(zhì)）外，其他土壤理化性質(zhì)對土壤Zn 毒性的貢獻(xiàn)在統(tǒng)計學(xué)上均不顯著，所建立的模型P值均大于0.05。其中非晶質(zhì)鋁含量通常被認(rèn)為與土壤吸附能力緊密相關(guān)，更高含量的非晶質(zhì)鋁可以為土壤中重金屬提供更多吸附點位。研究發(fā)現(xiàn)，利用pH 和w（有機(jī)質(zhì)）構(gòu)建的毒性預(yù)測模型可較好地預(yù)測Zn 對微生物（PNR 實驗）、大麥、西紅柿及小白菜生長的毒性差異[3]，且pH 和w（有機(jī)質(zhì)）也是影響Cu 對白符跳毒性閾值的重要理化性質(zhì)[31]。當(dāng)pH 較低時，有效態(tài)Zn 濃度較高，而在高土壤pH條件下，金屬與其他離子的結(jié)合沒有H+參與競爭，導(dǎo)致Zn2+可沉淀為氫氧化物或者經(jīng)過絡(luò)合作用可形成Zn2+的絡(luò)離子，從而導(dǎo)致溶解度降低，則Zn 的有效性也隨之降低。土壤溶液中的Zn2+數(shù)量是決定重金屬毒性大小的重要條件，而土壤中富含的不溶性Fe和Al含水氧化物可為重金屬離子提供可吸附的表面點位[32]，這是導(dǎo)致土壤溶液中游離的Zn2+數(shù)量減少的一個原因，故更多的不溶性Fe 和Al 含水氧化物可以顯著降低生物毒性。此外土壤有機(jī)質(zhì)包含小分子有機(jī)酸、胡敏酸、富里酸等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的高分子化合物，本身存在大量的含氧活性功能團(tuán)，可以通過金屬螯合作用與金屬離子形成絡(luò)合物沉淀產(chǎn)生固定作用（如胡敏酸與金屬離子絡(luò)合生成難溶性沉淀）[33]，土壤對Zn 的吸附能力極大增強(qiáng)，土壤溶液中Zn2+的濃度大幅降低，即土壤有機(jī)質(zhì)/碳的增加導(dǎo)致Zn 毒性的下降。不同的土壤理化性質(zhì)影響重金屬離子在土壤中的環(huán)境行為，土壤復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為各種絡(luò)合反應(yīng)、吸附反應(yīng)提供了結(jié)合位點，有效降低了游離Zn2+的數(shù)量，同時也降低了重金屬的生物毒性。

4 結(jié)論

（1）以白符跳的繁殖作為慢性毒性試驗的測試終點較為敏感。

（2）土壤CaCl 提取態(tài)Zn 可解釋不同受試土壤之間的毒性差異。

（3）根據(jù)毒性預(yù)測模型顯示，影響不同土壤中Zn對白符跳EC50差異的單一因素是土壤pH，在模型中引入w（有機(jī)質(zhì)）因子后預(yù)測能力顯著提高。