郭仲杰,蔡志欣,曾志恒,盧圓萍,陳美元,廖劍華
(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,福建 福州 350014)
供試的棕色蘑菇ARP088、MC441和白色蘑菇As2796,均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所遺傳育種研究室提供。
PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯(去皮)200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1000 mL,pH自然;
發(fā)酵棉籽殼試管培養(yǎng)基:發(fā)酵棉籽殼65%、發(fā)酵牛糞粉20%,麩皮12%、石灰1%,石膏1%、輕鈣1%、含水量65%;
培養(yǎng)料:二次隧道發(fā)酵的麥秸雞糞培養(yǎng)料;栽培種:自制的透氣袋小米栽培種。
1.3.1 雜交技術(shù)
不育單孢菌株的分離、培養(yǎng)、鑒定和配對(duì)雜交技術(shù),雜交菌株的篩選、鑒定方法均參考文獻(xiàn)[5~7]。
1.3.2 酯酶同工酶標(biāo)記測(cè)定
酯酶同工酶電泳樣品和聚丙烯酰胺凝膠制備、電泳方法和結(jié)果分析均參考文獻(xiàn)[8,9]。
1.3.3 生物學(xué)特性測(cè)定
⑴ 溫度試驗(yàn)
采用發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基法:將同一菌株接種于試管發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基,分別在5、10、15、20、25、30 ℃和35 ℃條件下培養(yǎng),3個(gè)重復(fù),觀(guān)測(cè)其走菌速率。
⑵ 含水量試驗(yàn)
采用發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基法:將同一菌株分別含水量為50%、55%、60%、65%、70%接種于試管發(fā)酵棉籽殼培養(yǎng)基,25 ℃條件下培養(yǎng),3個(gè)重復(fù),觀(guān)測(cè)其走菌速率。
⑶ pH值試驗(yàn)
采用PDA培養(yǎng)基法:分別配制pH值為4、5、6、7、8、9和10的PDA平板培養(yǎng)基,將同一菌株接種于其中,25 ℃條件下培養(yǎng),3個(gè)重復(fù),觀(guān)測(cè)其走菌速率。
1.3.4 栽培篩選
⑴ 初篩試驗(yàn)
采用塑料筐栽培法,每筐栽培面積為0.17 m2,培養(yǎng)料填投量為100.0 kg/m2,栽培種播種量為1.0 L/m2,混播。每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù),床架上隨機(jī)排列。
⑵ 復(fù)篩試驗(yàn)
采用床架式分區(qū)栽培法,每區(qū)栽培面積1.0 m2,培養(yǎng)料填投量為100.0 kg/m2,栽培種播種量為1.0 L/m2,混播。每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù), 床架上隨機(jī)排列。
⑶ 中試試驗(yàn)
采用空調(diào)控溫菇房床架式栽培法,每個(gè)菌株栽培面積100.0 m2,培養(yǎng)料填投量為100.0 kg/m2,栽培種播種量為1.0 L/m2,混播,每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)。
在初篩、復(fù)篩和中試生產(chǎn)試驗(yàn)過(guò)程中,播種、覆土?xí)r間同步進(jìn)行,栽培管理按常規(guī)方式。分別觀(guān)察不同菌株的菌絲生長(zhǎng)速率、農(nóng)藝性狀和產(chǎn)質(zhì)量。
以酯酶同工酶為標(biāo)記,從棕色蘑菇ARP088分離出不育單孢菌株10株;從白色蘑菇As2796分離出不育單孢菌株29株,配對(duì)雜交,獲得雜交新菌株36株。其中M026是不育單孢菌株ARP088-S9與As2796-S1雜交獲得新雜交菌株。
2.2.1 溫度試驗(yàn)
測(cè)定結(jié)束后,將5 ℃和35 ℃條件下的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接開(kāi)PDA平板培養(yǎng)基上,5 ℃條件下的接種塊重新蔭發(fā)走菌;35 ℃條件下接種塊沒(méi)有蔭發(fā)。雜交新菌株M026菌絲生長(zhǎng)的溫度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 1。不同溫度的菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明,雜交新菌株M026的菌絲生長(zhǎng)溫度范圍為10~35 ℃,適宜生長(zhǎng)溫度為25 ℃,休眠溫度為5 ℃,致死溫度為35 ℃。
表1 不同溫度下M026菌絲生長(zhǎng)速率
表2 不同含水量下M026菌絲生長(zhǎng)速率
表3 不同pH值培養(yǎng)基下M026菌絲生長(zhǎng)速率
2.2.2 含水量試驗(yàn)
雜交新菌株M026菌絲生長(zhǎng)的含水量試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。不同含水量的培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明,雜交新菌株M026的菌絲生長(zhǎng)的適合范圍為50%~70%,適宜生長(zhǎng)的范圍為50%~65%。
2.2.3 pH 值試驗(yàn)
在不同pH值的平板培養(yǎng)基上,雜交新菌株M026的菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表3。
不同pH值的平板培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明:雜交新菌株M026的菌絲在PDA平板上生長(zhǎng)的pH值范圍為5~10,適宜生長(zhǎng)平板pH值為7。
雜交新菌株M026的酯酶同工酶標(biāo)記鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。
雜交新菌株W192的酯酶同工酶表型為HG5型,呈典型的雜合態(tài)。
2.4.1 初篩試驗(yàn)
根據(jù)子實(shí)體的顏色,淘汰了白色或米黃色菌株;根據(jù)子實(shí)體單粒重量和菌蓋平均直徑,淘汰了3株朵形較小的菌株,同對(duì)照菌株MC441的單位平均產(chǎn)量相比較,淘汰了產(chǎn)量低的菌株,優(yōu)選部分雜交棕色菌株進(jìn)入復(fù)篩試驗(yàn)。
圖1 雜交新菌株M026的酯酶同工酶圖譜
2.4.2 復(fù)篩試驗(yàn)
部分復(fù)篩雜交菌株的出菇、產(chǎn)量和單粒重的結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 部分復(fù)篩參試菌株的出菇、產(chǎn)量和單粒重表
表6 中試試驗(yàn)菌株的子實(shí)體農(nóng)藝性狀
表7 中試試驗(yàn)菌株的出菇、產(chǎn)量和單粒重結(jié)果
初篩優(yōu)選出的菌株經(jīng)過(guò)復(fù)篩比較試驗(yàn)的結(jié)果表明,雜交新菌株M026與對(duì)照MC441相比較,產(chǎn)量提高了14.4%,單粒重量提高8.8%。
2.4.3 中試試驗(yàn)
中試菌株的子實(shí)體農(nóng)藝性狀結(jié)果見(jiàn)表6,出菇、產(chǎn)量和單粒重結(jié)果見(jiàn)表7。
在中試試驗(yàn)中,棕色蘑菇雜交新菌株M026菌蓋呈棕色、圓整厚實(shí),采摘后沒(méi)有褐變,菌柄長(zhǎng)度直徑適中;子實(shí)體單生,管理方便;與對(duì)照MC441相比較,產(chǎn)量提高12.4%,單粒重量提高13.0%。
雙孢蘑菇新菌株的選育方法主要采用不育單孢分離雜交技術(shù),該技術(shù)在白色雙孢蘑菇新品種選育上運(yùn)用非常成熟,而國(guó)內(nèi)棕色蘑菇的選育少有運(yùn)用不育單孢分離雜交技術(shù)的報(bào)道。
本研究運(yùn)用單孢分離雜交技術(shù)雜交出新棕色菌株,通過(guò)酯酶同工酶標(biāo)記鑒定,出菇栽培篩選方法,得到了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新棕色菌株M026,為改變我國(guó)蘑菇栽培品種長(zhǎng)期以來(lái)單一白色品種的局面和商品多元化做了前期探索。由于棕色蘑菇種質(zhì)資源少,在棕色蘑菇不同菌株內(nèi)進(jìn)行雜交育種,雜交范圍窄,存在較難獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的遺傳的可能性。今后運(yùn)用白色雙孢蘑菇與棕色蘑菇進(jìn)行雜交育種,是棕色蘑菇新品種選育新途徑。