李思雨，王 潔，Mahamane Doby Djibril，謝子康，左慧懿，唐承業(yè)，唐東永，衷 昕，梁 皓

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，南寧 530021）

衰老標(biāo)記蛋白30（SMP30）是一種隨年齡增長(zhǎng)而逐漸減少的鈣調(diào)節(jié)蛋白[1]，其含量不受性別因素的影響，是一種新型的抗衰老因子[2]。目前對(duì)SMP30 的研究主要集中在肝、腎及心臟等領(lǐng)域，并發(fā)現(xiàn)其具有抗細(xì)胞凋亡、抗氧化損傷、調(diào)控細(xì)胞增殖、參與維生素C合成、維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)等作用[3-7]。但目前有關(guān)SMP30 在晶狀體上皮細(xì)胞（LECs）中的表達(dá)情況及其作用鮮少報(bào)道。本研究通過(guò)觀察大鼠自然衰老過(guò)程中晶狀體形態(tài)變化和LECs 凋亡情況，并檢測(cè)不同月齡大鼠LECs 中SMP30 的表達(dá)，以明確大鼠LECs 中SMP30 的表達(dá)與年齡的關(guān)系，為研究SMP30 在LECs 中的作用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24 只不同月齡（0～1 月齡8 只、8～9月齡16 只）SPF 級(jí)Wistar 大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，給予常規(guī)固體飼料，自由飲水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已取得廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)：201909018。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及自然衰老動(dòng)物模型的建立 將大鼠按照鼠齡分為3組：1～2月齡組、9～10月齡組、18～19月齡組。首先購(gòu)買8只8～9月齡大鼠，飼養(yǎng)至17～18月齡時(shí)，再次購(gòu)買8只8～9月齡和8只0～1月齡大鼠，均繼續(xù)飼養(yǎng)1 個(gè)月，即獲得18～19 月齡、9～10 月齡、1～2月齡的3組大鼠。

1.3 晶狀體形態(tài)觀察 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，用美麗多復(fù)方托吡卡胺滴眼液對(duì)大鼠進(jìn)行散瞳，共滴兩次，每次間隔5 min。通過(guò)裂隙燈觀察晶狀體是否渾濁并拍照。

1.4 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測(cè) 大鼠深度麻醉后開(kāi)腹，通過(guò)腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后離心，取上層血清，檢測(cè)血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性和丙二醛（MDA）含量。試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 TUNEL 法檢測(cè)大鼠LECs 凋亡 麻醉處死大鼠后迅速摘取眼球，置于甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片。切片經(jīng)脫蠟、水化、洗滌、蛋白酶K工作液消化、破膜工作液破膜處理，按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)（Servicebio 公司）配置TUNEL反應(yīng)液，染色及血清封閉過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最后DAB顯色、蘇木精復(fù)染后，脫水封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果，凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。選取晶狀體前囊膜區(qū)域，Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=LECs凋亡細(xì)胞數(shù)目/LECs總數(shù)×100%。

1.6 間接免疫熒光法檢測(cè)大鼠LECs 中SMP30 蛋白表達(dá) 切片脫蠟、水化、EDTA 抗原修復(fù)、PBS 洗滌，BSA 封閉30 min，棄去BSA，放入濕盒中，加SMP30 鼠單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology 公司），存放于4°C 冰箱中孵育過(guò)夜。用PBS 洗后加相應(yīng)二抗室溫下避光孵育50 min，PBS洗滌，加DAPI，10 min后PBS洗滌，封片。熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選取晶狀體前囊膜區(qū)域拍照，使用Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度越高，表示SMP30蛋白表達(dá)越高。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清中SOD、GSH-PX活性和MDA含量比較 隨著大鼠月齡的增長(zhǎng)，其血清中SOD 和GSHPx活性呈降低趨勢(shì)，而MDA含量呈升高趨勢(shì)。18～19 月齡組SOD 活性低于9～10 月齡組和1～2 月齡組，GSH-PX 活性顯著低于1～2 月齡組，MDA 含量明顯高于9～10 月齡組和1～2 月齡組（均P＜0.05）；9～10月齡組GSH-PX活性明顯低于1～2月齡組（P＜0.05），而SOD活性和MDA含量與1～2月齡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠血清SOD、GSH-PX活性和MDA含量比較

表1 3組大鼠血清SOD、GSH-PX活性和MDA含量比較

與1～2月齡組比較，*P＜0.05；與9～10月齡組比較，#P＜0.05。

2.2 晶狀體形態(tài)學(xué)觀察 散瞳后通過(guò)裂隙燈觀察顯示3組大鼠晶狀體均透明，見(jiàn)圖1。

2.3 3 組細(xì)胞凋亡率比較 1～2 月齡組、9～10 月齡組、18～19 月齡組大鼠LECs 凋亡率分別為（27.51±9.39）%、（32.84±3.76）%、（45.50±9.18）%，18～19 月齡組大鼠LECs 凋亡率顯著高于1～2 月齡組和9～10月齡組（P＜0.05)，1～2 月齡組與9～10 月齡組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.4 大鼠LECs 中SMP30 蛋白的表達(dá) SMP30 在3組晶狀體囊膜LECs中均呈陽(yáng)性表達(dá)，F(xiàn)ITC染色呈綠色熒光。1～2月齡組、9～10月齡組、18～19月齡組大鼠LECs 中SMP30 表達(dá)的熒光強(qiáng)度分別為4.36±1.98、2.73±1.14、0.75±0.39，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中1～2月齡組熒光強(qiáng)度最高，9～10月齡組次之，18～19月齡組最低，見(jiàn)圖3。

圖1 3組大鼠晶狀體裂隙燈下形態(tài)學(xué)觀察圖像

圖2 TUNEL染色觀察3組大鼠LECs凋亡情況（×400）

圖3 間接免疫熒光法染色觀察3組大鼠LECs中SMP30蛋白表達(dá)（×400）

3 討論

Wistar 大鼠是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、容易繁殖、機(jī)體生理病理變化和代謝類型與人類比較接近等特點(diǎn)。大鼠的鼠齡與人的年齡有一定對(duì)應(yīng)關(guān)系，即1 月齡左右大鼠相當(dāng)于人的幼年階段，6 月齡左右大鼠相當(dāng)于人的青年階段，12 月齡左右大鼠相當(dāng)于人的成年階段，大于18月齡大鼠相當(dāng)于人的老年階段[8]。本實(shí)驗(yàn)大鼠長(zhǎng)時(shí)間飼養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)受到飼養(yǎng)環(huán)境、自身疾病等無(wú)法控制因素的影響，與研究目的綜合考慮，選擇把大鼠分為1～2 月齡組、9～10 月齡組和18～19 月齡組3組，模擬人的自然衰老過(guò)程，建立大鼠自然衰老模型，研究在大鼠自然衰老過(guò)程中，血清和晶狀體衰老指標(biāo)的改變以及LECs中SMP30的表達(dá)變化。

衰老的機(jī)制十分復(fù)雜，研究者提出機(jī)體內(nèi)自由基代謝紊亂、細(xì)胞衰老、基因組不穩(wěn)定、端?？s短及表觀遺傳學(xué)改變等均為衰老形成的重要因素[9]，其中氧自由基學(xué)說(shuō)是發(fā)展較早、學(xué)界接受度較高的一種衰老理論，此理論指出氧化應(yīng)激是導(dǎo)致衰老的重要原因。細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成能力與清除能力處于動(dòng)態(tài)平衡中，若二者失去平衡，將導(dǎo)致氧化應(yīng)激[10]。SOD 與GSH-PX 是細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑，通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基來(lái)發(fā)揮抗氧化作用[11]。ROS 產(chǎn)生過(guò)多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，造成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積，使細(xì)胞受損、生命活力低下，導(dǎo)致器官功能不斷減退，機(jī)體逐漸進(jìn)入衰老階段[12]。因此，在衰老動(dòng)物體內(nèi)，SOD、GSH-PX 的活性較低，MDA 的含量較高。目前常用MDA、SOD和GSH-PX 等指標(biāo)驗(yàn)證衰老模型的建立是否成功。本研究結(jié)果顯示，隨著大鼠月齡的增長(zhǎng)，其血清中SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05)。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的自然衰老模型構(gòu)建成功。

SMP30 是一種隨年齡增長(zhǎng)而逐漸減少的鈣調(diào)節(jié)蛋白[1]，其含量不受性別因素的影響，是一種新型的抗衰老因子[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SMP30 的表達(dá)與LECs 的凋亡相關(guān)。在臨床研究中，SMP30 在人晶狀體前囊膜LECs 周邊部表達(dá)較強(qiáng)，中央部表達(dá)較弱，LECs 的凋亡程度與SMP30 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[13-14]。在細(xì)胞體外培養(yǎng)研究中，人LECs 系SRA01/04 細(xì)胞在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，下調(diào)SMP30 的表達(dá)可使細(xì)胞凋亡率升高[15]；在高鈣及氧化狀態(tài)下，SMP30 對(duì)SRA01/04 細(xì)胞可產(chǎn)生促增殖、抗氧化及抗凋亡的保護(hù)作用，且與表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系[16-19]。本研究探討SMP30 在不同月齡大鼠LECs中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在大鼠自然衰老模型中，隨著月齡的增加，盡管大鼠晶狀體未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，但其LECs 的凋亡程度加重，SMP30 表達(dá)量已經(jīng)減少，由此推測(cè)，在大鼠衰老的過(guò)程中，SMP30可能作為一種保護(hù)性蛋白，參與了LECs的細(xì)胞損傷進(jìn)程，起到一定程度的抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于僅從細(xì)胞層面檢測(cè)到LECs 的凋亡變化，沒(méi)有觀察晶狀體形態(tài)學(xué)的改變，可能由于大鼠個(gè)體差異大、月齡不夠大或者LECs 代謝障礙程度尚未超過(guò)SMP30 對(duì)LECs 的保護(hù)作用等，具體因素還需后續(xù)研究。

綜上所述，隨著大鼠月齡的增加，其LECs凋亡增加，SMP30表達(dá)降低，提示SMP30可能是LECs的保護(hù)因子，在大鼠衰老過(guò)程中具有抗LECs 凋亡的保護(hù)作用。但是，SMP30 對(duì)LECs 發(fā)揮保護(hù)作用的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。未來(lái)，本組擬通過(guò)改變大鼠眼內(nèi)SMP30 的表達(dá)量，進(jìn)一步觀察SMP30抗凋亡、抗氧化和維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)等方面的調(diào)控作用。