胡文文，王嘉偉，張盛清，高 明，鄭 立

（1.廣西醫(yī)科大學生命科學研究院，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；3.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西－東盟重大疾病預防協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021）

骨關節(jié)炎（OA）也被稱為退行性骨病，其臨床癥狀通常表現(xiàn)為關節(jié)腫痛、活動受限等，嚴重甚至導致關節(jié)畸形和肌肉萎縮[1]。在臨床上，針對OA主要是緩解疼痛、減少畸形等對癥治療[2]。目前大量基礎研究的開展對OA的發(fā)生發(fā)展有了更近一步的認識，但其具體發(fā)病機制仍不清楚。主要認為OA 發(fā)病最重要的原因是活性氧（ROS）失衡[3]。因此，一種新型安全有效靶向ROS 失衡的藥物亟待被開發(fā)。納米酶是一種與蛋白質類似具有酶活性的納米材料，Mil-88a 屬于金屬－有機骨架材料（MOFs）納米酶家族的一員，具有過氧化物酶模擬物活性和良好的生物相容性[4]，因此被認為是清除ROS，促進OA 修復，具有前景的納米酶修復系統(tǒng)。本研究探討Mil-88a 納米酶通過清除ROS 促進OA 修復的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 動物 新生3～5 d 齡、體重約12 g 清潔級SD大鼠，來自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號為SYXK桂2020-0004，已取得廣西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 無水氯化鐵（FeCl3）（阿拉丁試劑有限公司，上海）；富馬酸（fumaric acid）（Sigma，美國）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，上海）；納米四氧化三鐵（Fe3O4）（上海麥克林生化科技有限公司，上海）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（Sigma，美國）；羥自由基檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；細胞增殖－毒性檢測試劑盒（CCK-8）（賽國生物科技有限責任公司，廣州）；鈣黃綠素（Calcein-AM）、碘化丙啶（PI）（Sigma，美國）；過氧化氫（H2O2）（成都金山化學試劑有限公司）；組織細胞RNA 小量提取試劑盒（Magon，美國）；95%乙醇（廣西博恒醫(yī)療用品有限公司）；抗體白細胞介素-1β（IL-1β）（博士德生物工程有限公司，美國）；山羊血清（北京中杉金橋生物技術有限公司）；FITC標記山羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，美國）；胎牛血清、高糖培養(yǎng)基（卡邁舒生物科技有限公司，中國）。

1.1.3 儀器與設備 掃描電子顯微鏡、X 射線多粉末衍射儀（XRD）（Rigaku，美國）；熱重分析儀（林賽斯上?？茖W儀器有限公司）；納米粒度及Zeta 電位分析儀（Zetasizer Nano ZS，中國）；全波長酶標儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；梯度PCR儀、定量PCR儀（賽默飛世爾科技中國有限公司）；真空離心濃縮儀、多功能臺式告訴冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；Mili-Q 純水機（廣西南寧市博美生物科技有限公司）；傅里葉紅外光譜儀、熒光成像分析系統(tǒng)顯微鏡（OLYMPUS，日本）。

1.2 材料合成

Mil-88a 的制備過程在已有文獻的技術上進行改進。首先，稱取0.974 4 g（8.4 mmoL）富馬酸與2.272 2 g（8.4 mmoL）Fecl3，即n（富馬酸/FeCl3）=1∶1。將上述物質溶解于42 mL 的超純水中后，經過1～2 h 的攪拌，轉移到100 mL 的內襯聚四氟乙烯的反應釜中，將反應釜放置在鼓風干燥箱中，在85 ℃下反應2 h。2 h 后取出反應釜，將反應釜置于室溫冷卻。待反應釜冷卻后，將溶液在10 000 r/min條件下離心10 min得到磚紅色固體，隨后將其倒入燒杯中，用無水乙醇洗滌3 次，再次離心得到固體后，放入真空干燥箱在100 ℃干燥6 h，干燥所得固體即為所述的金屬有機骨架Mil-88a，并留作備用。

1.3 Mil-88a的表征

將上述干燥的材料，取一部分粉末分別用于SEM、XRD、TGA、FTIR 表征，另取少量粉末超聲分散于超純水中，用于粒度分析和ZETA電位測量。

1.4 Mil-88a的SOD清除率檢測

利用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產生超氧陰離子的原理，按照試劑盒說明書，分別配置WST 工作液和酶工作液。另取一定量的樣品粉末配制成一定濃度的母液，在1.5 mL EP 管內與純水按不同比例混合得到不同濃度的樣品溶液，先后加入一定量的WST 工作液與酶工作液，充分混勻后于37 ℃下孵育20 min，充分離心去除材料后測量上清液450 nm處吸光值并與對照組進行比較和計算，每組重復3次。

1.5 Mil-88a的羥自由基清除率檢測

利用芬頓反應產生羥自由基，羥自由基與顯色劑互相作用的原理，按試劑盒說明書配制不同濃度的Mil-88a 溶液，測量不同濃度下Mil-88a 的羥自由基清除效率，每組重復3次。

1.6 軟骨細胞原代培養(yǎng)

軟骨組織從5 d 齡的SD 大鼠分離，用含10%雙抗的PBS 沖洗去除血塊。在37 ℃，用0.25%胰蛋白酶孵育消化1.5 h 后，更換0.02%Ⅱ型膠原酶消化過夜，分離出游離細胞。待游離細胞貼壁后，每兩天更換一次培養(yǎng)基，傳至P3～P5代使用。

1.7 生物相容性檢測

（1）CCK-8法：將100 μL 5×104/mL P3～P5軟骨細胞接種于96 孔板中過夜，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基分別加入100 μL 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL，10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL培養(yǎng)基重懸的Mil-88a。繼續(xù)細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h 后徹底移除培養(yǎng)基，PBS沖洗兩遍徹底去除材料，加入按1∶10 配置好的含培養(yǎng)基的CCK-8 110 μL，在37 ℃下培養(yǎng)1 h。孵育完成后小心吸取上清培養(yǎng)基移至新的96 孔板內，用酶標儀測量450 nm 處吸光度。每組重復3 次。（2）細胞活死染色：將5 000 個P3～P5 軟骨細胞接種于96 孔板中過夜，待貼壁后更換1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL Mil-88a共孵育24 h后，去除培養(yǎng)基PBS 沖洗2 次。100 μL Calcein-AM/PI 染色工作液被加入避光培養(yǎng)20 min，PBS去除多余染料，在共聚焦顯微鏡100倍下隨機選取3視野觀察。

1.8 PCR檢測

將每孔30×104/mL 細胞接種于6 孔板內，培養(yǎng)24 h 后去除舊培養(yǎng)基并用PBS 徹底沖洗，隨后加入濃度為450 μmol/L 用無血清培養(yǎng)基配制的H2O2誘導液1 mL，充分誘導細胞后加入等體積的不同濃度的無血清培養(yǎng)基配制的Mli-88a 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。隨后PBS 徹底沖洗去除材料與培養(yǎng)基，提取RNA用于PCR實驗。各引物序列,見表1。

表1 PCR的引物序列

1.9 免疫熒光

每孔種植75000個同代軟骨細胞于已放置爬片的24孔板中，貼壁過夜后用0.25 mL混有H2O2的無血清培養(yǎng)基37 ℃下對細胞進行氧化應激誘導20 min 后，加入濃度分別為1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL Mil-88a 和培養(yǎng)基混合和溶液0.25 mL，再孵育24 h后，用PBS 緩沖液清洗3 次細胞，4%多聚甲醛固定25 min，再用PBS 清洗3 次，然后加入3%的H2O2孵育15 min，PBS 清洗3 次，再與山羊血清一同孵育30 min。封閉處理之后，將稀釋后的IL-1β 的一抗（1∶200），滴加在爬片上，4 ℃冰箱過夜孵育。隨后，用生物素標記的山羊抗兔二抗（1∶500）和稀釋液孵育1 h。最后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）標記細胞核，黑暗條件下孵育10 min，緩沖液清洗3次后，吸走爬片上的水分，用中性樹脂封片后，通過熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。多組間比較采用ANOVA 單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 掃描電鏡

電鏡顯示合成的Mil-88a呈六角桿狀，見圖1。

圖1 Mil-88a電鏡圖

2.2 XRD表征

Mil-88a 在整個圖譜中整體主峰并未出現(xiàn)較大偏移。在6°～15°中出現(xiàn)3 個特征峰，分別是2.8°、10.4°和12.9°，見圖2。

2.3 TGA與FTIR表征

Mil-88a 在100 ℃至300 ℃范圍中，質量保持率基本不變。FTIR 顯示Mil-88a 具有FeCl3與富馬酸所有特征峰，見圖3。

圖2 XRD表征

圖3 TGA與FTIR表征

2.4 Mil-88a的生物相容性評價

2.4.1 CCK-8 法 當Mil-88a 濃度在1～10 μg/mL時，軟骨細胞存活率維持在80%以上，見圖4。

圖4 Mil-88a不同濃度干預24 h軟骨細胞增殖影響

2.4.2 細胞活死染色 當濃度大于10 μg/mL時，對軟骨細胞表現(xiàn)較強的毒性（P＜0.001），見圖5。

2.5 Mil-88a的ROS清除作用

伴隨著Mil-88a 濃度升高，Mil-88a 的SOD 清除率逐漸升高（P＜0.001），羥自由基清除率與Fe3O4相比具有差異，但清除效率不隨Mil-88a 改變（P＜0.05），見圖6。

2.6 PCR 檢測IL-1β、TNF-α、SOD1、SOD2 表達情況

Mil-88a濃度依賴性下調IL-1β、SOD1、SOD2的表達（均P＜0.05）。TNF-α 的表達下降（P＜0.05），但是不隨Mil-88a濃度改變，見圖7。

2.7 免疫熒光染色

H2O2誘導軟骨細胞IL-1β 表達隨著Mil-88a 濃度上升逐漸下降，見圖8。

圖5 Calcein-AM/PI染色檢測Mil-88a不同濃度干預24h軟骨細胞活死影響

圖6 Mil-88a不同濃度24 h對SOD、OH清除率影響

圖7 Mil-88a對軟骨細胞IL-1β、TNF-α、SOD1、SOD2表達影響

圖8 免疫熒光染色觀察不同濃度下IL-1β表達情況

3 討論

在中國大約有16.2%患者長期遭受OA的困擾，難以忍受的疼痛與極高致殘率嚴重影響患者生活質量，破壞影響家庭社會的穩(wěn)定[5]。雖然進行了大量的基礎研究，目前對OA 的病因和發(fā)病機制尚無定論，主要認為與年齡、職業(yè)、勞損和內分泌等因素有關[6-7]，其中過量的ROS是導致關節(jié)炎炎性病變的重要因素之一，作為治療OA的潛在靶點，如何逆轉ROS失衡已經成為治愈OA的關鍵[8]。

MOFs是一種由金屬節(jié)點和有機配體通過化學鍵自組裝形成具有特殊3D 網(wǎng)絡結構的納米粒子。具有比表面積大，可調節(jié)的孔徑，穩(wěn)定的物化性質被認為具有前景的仿生納米酶[9]。Wu 等[10]報道MOFs 的特殊金屬節(jié)點結構具有氧化酶類似物活性，被認為清除ROS 的理想納米酶。在本研究中，Mil-88a 電鏡顯示呈六角桿狀，XRD 在6°～15°出現(xiàn)3個特征峰與先前報道吻合[11]。FTIR具有所有原材料特征峰，TGA證實在100～300 ℃左右Mil-88a仍具有良好的穩(wěn)定性。為了驗證Mil-88a 的細胞毒性，CCK-8 與活死染色提示當Mil-88a 濃度小于10 μg/mL 時基本沒有細胞毒性（P＜0.001）?？偠灾?，Mil-88a成功被合成且具有良好的生物相容性。

OA 主要表現(xiàn)為軟骨的缺損，減輕軟骨細胞的氧化應激與清除過量活性氧的產生將有利于軟骨的再生[12-13]，ROS包括SOD和OH等[14]。進一步驗證Mil-88a的ROS清除率，結果顯示，Mil-88對SOD清除率程濃度依賴性（P＜0.001），OH清除率不隨濃度改變但仍高于Fe3O4（P＜0.05），提示可能并不是單單歸結于其多孔物理結構清除ROS，具體機制仍有待進一步研究。結局表明，Mil-88a具有作為清除關節(jié)腔ROS納米酶的潛力。

ROS作為調控炎癥的重要信號分子，ROS的失衡導致TNF-α 與IL-1β 炎癥因子的異常表達，先前文獻報道TNF-α與IL-1β與軟骨破壞與滑膜炎的發(fā)生密切相關[15-17]，TNF-α作為軟骨膠原生成關鍵性抑制劑，促進軟骨細胞的凋亡，TNF-α的激活通過上調IL-1β的炎癥扳機，引起炎癥級聯(lián)瀑布的發(fā)生[18]。在本研究中，伴隨著Mil-88a 濃度升高下調了軟骨細胞炎癥因子TNF-α的表達（P＜0.001），而IL-1β下調并不隨Mil-88a濃度改變（P＜0.001）。當Mil-88a濃度大于20 μg/mL 時下調了軟骨細胞氧化因子SOD1、SOD2 的表達（P＜0.001），然而當濃度大于20 μg/mL 時，SOD1、SOD2 基因的表達并沒有進一步的下降。在免疫熒光中與PCR結果一致，Mil-88a下調H2O2誘導軟骨細胞IL-1β炎癥因子的表達（P＜0.001）。

綜上所述，本研究成功合成了一種具有抗ROS酶活性的納米酶Mil-88a，具有良好的生物安全性，能夠下調H2O2誘導軟骨細胞中氧化和炎癥因子的表達，下一步我們將在動物體內治療關節(jié)炎癥其安全性和療效，并探明其清除ROS的潛在機制為臨床轉化提供可靠的實驗依據(jù)。