王新亮，彭福田

（1 濱州學(xué)院學(xué)報編輯部，山東 256603）（2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，國家作物生物學(xué)重點實驗室）

植物個體發(fā)育的過程分為童期和成年期。Zimmerman[1]指出：“童期是果樹實生苗能花芽分化之前的一段時間，果樹的童期一旦結(jié)束，就具有了開花的能力”。果樹實生苗在空間上還存在一定的童區(qū)：以根莖為圓心，以童程（實生苗始果點至根莖的枝干長度）為半徑的半球體空間[2]。童區(qū)不能形成花芽，而成年區(qū)能形成花芽。

關(guān)于童期向成年期轉(zhuǎn)變的生理機制，學(xué)術(shù)界有3 種假說。“成花素假說”認(rèn)為成花促進(jìn)或抑制因子是一種簡單的、特異的和廣譜的激素，但是這種激素還沒有被分離和確認(rèn)[3]；“營養(yǎng)分流假說”認(rèn)為植株內(nèi)部的源庫關(guān)系能調(diào)控所有與階段轉(zhuǎn)變和成花有關(guān)的因子，成花誘導(dǎo)時，莖尖得到比非誘導(dǎo)條件時更好的同化物供應(yīng)[4]；“多因子控制假說”認(rèn)為多種激素、代謝物、營養(yǎng)等物質(zhì)參與成花誘導(dǎo)。遺傳變異、過去和現(xiàn)在的生長狀況對不同的種類或基因型或同樣基因型在不同的環(huán)境下導(dǎo)致復(fù)雜的不同的限制因子[5]。近年來，研究者已經(jīng)克隆到許多與植物階段轉(zhuǎn)變或成花有關(guān)的基因，越來越多證據(jù)支持“多因子控制假說”[6-9]。

為了進(jìn)一步了解果樹童區(qū)與成年區(qū)葉片在基因表達(dá)上的差異，本文以6 年生的平邑甜茶實生苗為試材，利用數(shù)字基因表達(dá)譜測序技術(shù)研究了在花芽分化期平邑甜茶童區(qū)與成年區(qū)葉片在基因表達(dá)上的差異，以期進(jìn)一步揭示實生平邑甜茶由童區(qū)向成年區(qū)轉(zhuǎn)變的分子機制，為分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為6 年生平邑甜茶實生苗。花芽分化期（9 月5 日）分別取童區(qū)（Y2）和成年區(qū)（A2）的葉片儲存于-80 ℃用于提取RNA。

1.2 RNA 提取和cDNA 制備

用TRIzol（Invitrogen）試劑盒提取平邑甜茶葉片中的總RNA，并通過Dynabeads Oligo（dT）（InvitrogenDynal）分離得到mRNA。用DEPC 水溶解RNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測其質(zhì)量。用Oligo（dT）作為引物合成cDNA 第一條鏈。

1.3 基因差異表達(dá)分析

基因差異表達(dá)分析由華大基因協(xié)助完成。反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA 用NlaIII 限制性內(nèi)切酶消化，并用磁珠純化3′端cDNA 片段，然后在5′端接上Illumina adaptor1，再用MmeI 酶切CATG 位點下游17 bp 處，用磁珠去除3′片段，最后在3′端接上Illumina adaptor2，這樣就得到了21 bp 標(biāo)簽庫。經(jīng)PCR 線性擴增15 個循環(huán)后，用6%TBE PAGE 純化，然后通過Illumina 基因表達(dá)測序法測序。

1.4 原始數(shù)據(jù)處理

利用base calling 將測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，再經(jīng)過特定處理轉(zhuǎn)化為堿基序列標(biāo)簽。最后將所有標(biāo)簽對應(yīng)到Genome Database for Rosaceae 網(wǎng)站蘋果基因組V1.0（http://www.rosacea e.org/projects/apple_genome,Malus x domestica Geno me v1.0）[10]參考序列。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選

差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)：①不同處理間，同一基因的表達(dá)量存在2 倍及2 倍以上的差異；②錯誤率（false discovery rate FDR）小于0.001[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)簽概況

樣品A2 產(chǎn)生了5 917 214 個原始序列，樣品Y2 產(chǎn)生了6 126 204 個原始序列。去除雜質(zhì)序列后，A2 產(chǎn)生了5 635 494 個標(biāo)簽，Y2 產(chǎn)生了5 825 279個標(biāo)簽。與蘋果基因組預(yù)測基因（Apple Genome V1.0 predicted CDS）比對發(fā)現(xiàn)，A2 中有1 060 378個標(biāo)簽對應(yīng)到16 284 個基因上，Y2 中有1 216 762個標(biāo)簽對應(yīng)到15 719 個基因上（表1）。

表1 每個樣品獲得標(biāo)簽數(shù)量

2.2 差異表達(dá)基因的確認(rèn)與功能分析

通過與Y2 比較，在A2 中表達(dá)上調(diào)的基因有269 個，表達(dá)下調(diào)的基因有727 個。pathway 分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因中有606 個基因能對應(yīng)到pathway中，排名前30 的已經(jīng)在表2 中列出，差異表達(dá)基因主要集中在代謝途徑、次生代謝物的生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物-病原互作、核糖體、RNA轉(zhuǎn)運、苯丙烷類生物合成、淀粉和蔗糖代謝這些途徑中。

除了差異表達(dá)基因pathway 分析外，將差異比較大的基因（log2 Ratio（A2/Y2）≥7 or log2 Ratio（A2/Y2）≤-7）并通過NCBI 數(shù)據(jù)庫的BLAST 工具與其他植物的基因序列進(jìn)行比對。比對發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)的基因中主要參與含氮化合物轉(zhuǎn)運與代謝，如：寡肽轉(zhuǎn)運蛋白（MDP0000292270）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（MDP0000289011），生長素抑制蛋白（MD P0000323212），GTP 代謝相關(guān)基因（MDP0000617 187、MDP0000185787、MDP0000129000）。表達(dá)下調(diào)的基因涉及比較多的途徑如脫落酸合成（MDP0000929213 ），E3 泛素蛋白連接酶（MDP0000770377）等。但是它們中的部分序列仍沒找到明顯相似的序列，這說明這些序列可能在其他植物中研究較少或是蘋果中特有的（表3）。

表2 差異表達(dá)基因前30位通路分析

表3 表達(dá)差異比較大的基因

2.3 蔗糖和淀粉代謝酶編碼基因在童區(qū)與成年區(qū)葉片中的表達(dá)差異

通過pathway 分析，在差異基因中查找到19 個參與蔗糖和淀粉代謝的基因，其中3 個在成年區(qū)表達(dá)量高，16 個在童區(qū)表達(dá)量高。淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase（MDP0000182948）和淀粉酶（MDP00002 32760、MDP0000397284）編碼基因在成年區(qū)的表達(dá)比童區(qū)低。蔗糖非發(fā)酵-1 型相關(guān)蛋白激酶 1（SnRK1）在植物糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑中可能發(fā)揮著關(guān)鍵性開關(guān)的作用[12]，我們在蘋果預(yù)測基因中找到3 個SnRK1同源基因（MDP0000191788、MDP0000173500、MDP0000320932 ），其中MDP0000320932 在成年區(qū)的表達(dá)比童區(qū)高［Log2 ratio（A2/Y2）=1.46］（表4）。

表4 參與蔗糖和淀粉代謝的差異表達(dá)基因

2.4 赤霉素和細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)差異

赤霉素、生長素和細(xì)胞分裂素對花芽分化既有促進(jìn)方面的報道，也有抑制方面的報道，不同類型赤霉素對蘋果花芽分化的作用不同[13]。在本試驗中，赤霉素合成主要酶編碼基因（柯巴基焦磷酸合酶基因）MDP0000305417 和MDP0000147908 在成年區(qū)葉片中的表達(dá)高于童區(qū)，都是142 倍；1 個細(xì)胞分裂素合成關(guān)鍵酶—異戊烯基轉(zhuǎn)移酶編碼基因（IPT）在童區(qū)葉片中的表達(dá)是成年區(qū)的4.6 倍（表5）。

表5 參與赤霉素和細(xì)胞分裂素合成的差異表達(dá)基因

2.5 成花基因的表達(dá)差異

隨著研究的不斷深入，現(xiàn)在的研究主要集中到對成花基因的克隆及其功能的研究上。本試驗中，4 個PAF1 復(fù)合體同源基因（MDP0000141365、MDP0000130422、MDP0000210032、MDP000014182 8）在童區(qū)葉片的表達(dá)分別是成年區(qū)葉片表達(dá)量的2.4、3.1、4.2、3.4 倍。1 個GI同源基因（MDP00001 71530）在成年區(qū)和童區(qū)葉片中的表達(dá)存在差異，其在童區(qū)葉片的表達(dá)量是成年區(qū)葉片的2.4 倍。本試驗也發(fā)現(xiàn)1 個與PnFL-2同源性較高的基因（MDP0000322348）在成年區(qū)和童區(qū)葉片中的表達(dá)存在差異，其在童區(qū)葉片的表達(dá)是成年區(qū)葉片的13.2 倍。PFT1同源基因MDP0000220114 在童區(qū)葉片的表達(dá)是成年區(qū)葉片的6.4 倍。DNA 甲基化能終止春化作用，延遲開花[14]。本研究5 個甲基化相關(guān)酶基因中有4 個（MDP0000171530、MDP0000259 734、MDP0000312110、MDP0000223161）在成年區(qū)葉片的表達(dá)低于童區(qū)葉片（表6）。

3 討 論

pathway 分析發(fā)現(xiàn)，差異基因中有606 個基因能對應(yīng)到pathway 中，包括：碳和氮的固定、同化、代謝和降解，脂類合成和代謝，核酸代謝，次生代謝，植物激素信號等。因此，本研究也支持“多因子控制假說”。很多標(biāo)簽不能比對到預(yù)測基因上，這說明蘋果基因組的預(yù)測基因可能并不完全。

表6 成花基因的表達(dá)分析

3.1 花芽分化過程中糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)

花誘導(dǎo)后，植物莖尖分生組織中的蔗糖濃度會激增[15]，刺激細(xì)胞有絲分裂。蘋果屬植物施用葡萄糖、果糖或蔗糖后，能促進(jìn)其成花。但甘露醇不能起到同樣的作用，說明蔗糖在花誘導(dǎo)中是作為營養(yǎng)物質(zhì)，而不是調(diào)節(jié)滲透性[16]。King 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖是助劑，而不是成花誘因。通過pathway 分析，在差異基因中查找到19 個參與蔗糖和淀粉代謝的基因，其中3 個在成年區(qū)表達(dá)量高，16 個在童區(qū)表達(dá)量高。淀粉動員是花誘導(dǎo)早期的重要步驟[18]。淀粉合成關(guān)鍵酶AGPase（MDP0000182948）和淀粉酶（MDP0000232760、MDP0000397284）編碼基因在成年區(qū)的表達(dá)比童區(qū)低，說明可能淀粉合成和降解均降低。這時光合產(chǎn)物可能主要被運往花芽，為來年開花積累能量。SnRK1 在植物糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑中可能發(fā)揮著關(guān)鍵性開關(guān)的作用[12]，我們在蘋果預(yù)測基因中找到 3 個SnRK1同源基因（MDP0000191788、MDP0000173500、MDP00003209 32），其中MDP0000320932 在成年區(qū)的表達(dá)比童區(qū)高，這表明SnRK1 也可能在成花誘導(dǎo)方面起一定的作用。

3.2 花芽分化過程中激素合成相關(guān)基因的表達(dá)

研究證明，赤霉素能促進(jìn)擬南芥開花[19]。而不同類型赤霉素對蘋果樹花芽分化的作用不同[13]。超表達(dá)GA-20 氧化酶基因后，植物開花提前[20]。在本試驗中，赤霉素合成主要酶編碼基因（MDP0000305417 和MDP0000147908）在成年區(qū)葉片中的表達(dá)高于童區(qū)。說明蘋果可能通過赤霉素上調(diào)LEAFY的表達(dá)來促進(jìn)花器官的發(fā)育[21]。1 個IPT基因（MDP0000295823）在成年區(qū)葉片中的表達(dá)低于童區(qū)。IPT 是植物異戊二烯類細(xì)胞分裂素［反式玉米素（tZ），二氫玉米素（DHZ），順式玉米素（cZ），異戊烯基核糖基腺嘌呤（iP）］合成的關(guān)鍵限速酶[22]。李廣等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在花芽分化后期側(cè)柏葉片中的玉米素含量是降低的。本研究發(fā)現(xiàn)，成年區(qū)葉片中IPT表達(dá)量低于童區(qū)，可能是導(dǎo)致細(xì)胞分裂素含量降低的直接原因。

3.3 花芽分化過程中成花基因表達(dá)差異

在擬南芥中，F(xiàn)RI、FRL1、PAF1 和FLC 抑制花芽分化，而SOC1、FT、AP1 和LEAFY 促進(jìn)花芽分化[21,24]。本試驗中，4 個PAF1 復(fù)合體同源基因（MD P0000141365、MDP0000130422、MDP0000210032、MDP0000141828）在成年區(qū)葉片的表達(dá)低于童區(qū)葉片。PAF1 復(fù)合體刺激FLC的表達(dá)來抑制AP1和LEAFY的表達(dá)，延遲成花，因此平邑甜茶成年區(qū)秋季可能主要靠下調(diào)抑制花芽分化的PAF1 復(fù)合體同源基因的表達(dá)的方式來上調(diào)AP1同源基因（MDP0000124429）最終達(dá)到花芽分化。另外，GI參與光信號生物鐘響應(yīng)。OsGI超表達(dá)造成水稻延遲開花，而通過RNAi 沉默OsGI后的水稻開花提前[25]。但是擬南芥中GI表現(xiàn)出相反的功能[26]。本試驗也發(fā)現(xiàn)1 個GI同源基因（MDP0000171530）在成年區(qū)和童區(qū)葉片中的表達(dá)存在差異，其在成年區(qū)葉片的表達(dá)低于童區(qū)葉片，這說明它的功能可能和水稻OsGI一樣。Kim 等[27]報道，牽?；≒nFL-2受長日照誘導(dǎo)，其轉(zhuǎn)基因擬南芥在長日照條件下開花提前，PnFL-2 屬于TIFY 轉(zhuǎn)錄因子家族的ZML 亞族。本試驗也發(fā)現(xiàn)1 個與PnFL-2同源性較高的基因（MDP0000322348）在成年區(qū)葉片的表達(dá)低于童區(qū)葉片。據(jù)李肖琴[28]報道，MDP0000322348 雖然也屬于TIFY 轉(zhuǎn)錄因子家族，但其歸屬于TIFY 亞族，所以可能MDP0000322348 的表達(dá)特性和功能與牽牛花PnFL-2的不同。擬南芥光敏色素開花時間蛋白1（phytochrome and flowering time protein 1，PFT1）作用于光敏色素B 的下游調(diào)節(jié)FT的表達(dá)[29]。任保蘭等[30]發(fā)現(xiàn)，紅掌Aa PFT1在童期表達(dá)量高于成年期，而本研究發(fā)現(xiàn)，PFT1同源基因MDP0000220114成年區(qū)葉片的表達(dá)低于童區(qū)葉片。DNA 甲基化能終止春化作用，延遲開花[14]。齊思言[31]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果基本不成花的腋芽基因DNA 甲基化水平明顯高于易成花的短枝頂芽。菊花葉片經(jīng)短日照處理后DNA 甲基化也顯著降低[32]。石玉波等[33]認(rèn)為，DNA甲基化降低與花芽分化之間具有一定的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)4 個甲基化相關(guān)酶基因在成年區(qū)葉片的表達(dá)低于童區(qū)葉片，這說明甲基化也可能在調(diào)節(jié)平邑甜茶成年區(qū)花芽分化過程中起重要作用。