齊紅，李敏，張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南 250102）

木瓜為常用中藥，俗稱皺皮木瓜，最早載于《爾雅》，為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai 的干燥近成熟果實(shí)，可舒筋活絡(luò)，和胃化濕，臨床多用于治療由濕引起的各種筋病，如濕痹拘攣，轉(zhuǎn)筋攣痛，腰膝關(guān)節(jié)疼痛等，不作君藥，可作佐、使藥物［1］。光皮木瓜是皺皮木瓜常見的習(xí)用品［2］，光皮木瓜在山東、四川、河北、陜西等省的地方標(biāo)準(zhǔn)中有收載，兩者在原植物形態(tài)、藥材外觀性狀和活性成分等方面存在差異［3］，不能混用。木瓜收載于國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)始于《中國(guó)藥典》1963 年版一部，《中國(guó)藥典》2020 年版收載了27 個(gè)含有木瓜的復(fù)方制劑［4］。木瓜的主要化學(xué)成分包括齊墩果酸、熊果酸、綠原酸、蘋果酸、蘆丁、槲皮素、多糖、鞣質(zhì)等［5–9］，其中齊墩果酸、熊果酸不僅具有消炎抑菌、降低轉(zhuǎn)氨酶、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、防止肝硬化等功效，而且還具有一定的抗癌活性［10–11］，且以熊果酸尤為突出，是木瓜的主要藥效成分，因此測(cè)定木瓜中齊墩果酸和熊果酸具有重要意義。

目前測(cè)定齊墩果酸、熊果酸的方法主要是采用高效液相色譜法［12–14］。此外周靜等［15］采用氣相色譜法，以氮?dú)鉃檩d氣，選用HP1 毛細(xì)管柱（25 m×0.32 mm，0.52 μm），柱溫為280 ℃，氫火焰檢測(cè)器對(duì)女貞子中齊墩果酸和熊果酸含量進(jìn)行測(cè)定，要求柱溫較高，且易引起毛細(xì)管柱涂層流失。戴云等［16］采用分光光度法測(cè)定了齊墩果酸和熊果酸對(duì)DPPH 自由基的清除率，齊墩果酸和熊果酸分子結(jié)構(gòu)中僅有一個(gè)雙鍵，紫外吸收弱，操作簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確度較低。馮海燕等［17］采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定柿蒂中齊墩果酸和熊果酸含量，操作復(fù)雜，且重現(xiàn)性較差?！吨袊?guó)藥典》2020 年版木瓜藥材采用HPLC 法測(cè)定齊墩果酸、熊果酸的總量，該方法以甲醇–水–冰醋酸–三乙胺為流動(dòng)相，配制較復(fù)雜，且三乙胺會(huì)縮短色譜柱壽命。與《中國(guó)藥典》2015 年版相比，2020 年版木瓜質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)飲片項(xiàng)下增加了浸出物項(xiàng)目，飲片中齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定則未作規(guī)定。不同方法制備的木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸含量不同［18］，此外不同產(chǎn)地、不同品種木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸含量也存在差異。為評(píng)價(jià)木瓜飲片質(zhì)量，保證藥品質(zhì)量安全、有效，筆者從四川、湖北、安徽、山東等地收集部分皺皮木瓜和光皮木瓜市售飲片，通過試驗(yàn)對(duì)提取條件、色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地皺皮木瓜飲片中齊墩果酸和熊果酸含量的方法。與《中國(guó)藥典》2020年版一部木瓜含量測(cè)定方法相比，該方法操作簡(jiǎn)單、分離度好、準(zhǔn)確度高，可用于木瓜飲片中齊墩果酸和熊果酸的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試藥

高效液相色譜儀：LC–20AT 型，LCsolution 工作站，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ–600GDV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬能粉碎機(jī)：FW100 型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多儀器公司。

齊墩果酸對(duì)照品：批號(hào)為110709–201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

熊果酸對(duì)照品：批號(hào)為110742–201622，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

磷酸：分析醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

木瓜飲片樣品：皺皮木瓜飲片為貼梗海棠Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai 的果實(shí)，光皮木瓜為木瓜Chaenomeles sinensis(Thouin) Koehne 的果實(shí)，具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典Nouryon 公司）；流動(dòng)相：甲醇–0.3%磷酸（87∶13）溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流量：1.0 mL／min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 對(duì)照品混合溶液制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品8.96 mg，熊果酸對(duì)照品13.61 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成齊墩果酸、熊果酸的質(zhì)量濃度分別為0.082 2、0.128 9 mg／mL 的對(duì)照品混合溶液。

1.4 供試品溶液制備

精密稱取皺皮木瓜飲片細(xì)粉約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，密塞，稱量并記錄質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）40 min，冷卻至室溫，再次稱量并記錄質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品混合溶液、供試品溶液各10 μL，按1.2 色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)照品混合溶液和供試品溶液中齊墩果酸、熊果酸分離度均大于1.5，拖尾因子為1.04，理論板數(shù)按熊果酸色譜峰計(jì)不低于5 000。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)符合要求。對(duì)照品混合溶液、供試品溶液色譜圖如圖1 所示。

圖1 對(duì)照品混合溶液、供試品溶液色譜圖

2.2 提取條件選擇

以編號(hào)為16 的皺皮木瓜飲片樣品為待測(cè)對(duì)象，分別選擇甲醇、乙醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液3 種提取溶劑對(duì)齊墩果酸、熊果酸進(jìn)行提取，考察不同提取溶劑的提取效果，結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑時(shí)，色譜峰面積最大，基線平穩(wěn)，故采用甲醇為提取溶劑。以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲法、回流法、索氏提取法對(duì)齊墩果酸、熊果酸進(jìn)行提取，考察不同提取方法的提取效果，結(jié)果表明，3 種提取方法的色譜峰面積接近，但超聲法簡(jiǎn)單、方便，故選用超聲法對(duì)樣品進(jìn)行提取。分別考察超聲時(shí)間為20、40、60 min 時(shí)的提取效果，結(jié)果表明，超聲提取40 min 時(shí)，提取較完全，故選擇超聲時(shí)間為40 min。

2.3 色譜條件優(yōu)化

分別考察乙腈–0.3%磷酸溶液、甲醇–水–冰醋酸–三乙胺溶液、甲醇–0.3%磷酸溶液3 種流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈–0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，齊墩果酸、熊果酸分離度僅為1.3；以甲醇–水–冰醋酸–三乙胺溶液、甲醇–0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，齊墩果酸、熊果酸分離度均大于1.5。甲醇–水–冰醋酸–三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）溶液配制較復(fù)雜，三乙胺會(huì)縮短色譜柱壽命，且柱溫需控制在16～18 ℃，而甲醇–0.3%磷酸溶液（87∶13）配制簡(jiǎn)單，操作容易，綜合考慮，選擇甲醇–0.3%磷酸溶液為流動(dòng)相。

分別選擇Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、SHIMADZU VP–ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm） 和Kromasil 100–5–C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）對(duì)齊墩果酸、熊果酸進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)Kromasil 100–5–C18柱分離效果較好，齊墩果酸和熊果酸的色譜峰分離度均為1.7，其余兩款色譜柱的分離度均小于1.5。故選擇Kromasil 100–5–C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱。

2.4 線性方程與檢出限

自動(dòng)進(jìn)樣器分別自動(dòng)吸取1.3 中的對(duì)照品混合溶液8、10、12、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，在1.2 色譜條件下，依次進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)化合物的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。用甲醇逐級(jí)稀釋對(duì)照品混合溶液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以3 倍信噪比（S／N）對(duì)應(yīng)的溶液濃度作為方法檢出限。齊墩果酸、熊果酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。

表2 齊墩果酸、熊果酸的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇編號(hào)為16 的皺皮木瓜飲片，按1.4 方法制備供試品溶液，分別于制備完成后第0、2、4、6、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表3。由表3 可知，齊墩果酸、熊果酸色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.89%、1.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 精密度試驗(yàn)

取編號(hào)為16 的皺皮木瓜細(xì)粉6 份，每份約1.0 g，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，齊墩果酸、熊果酸色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.95%、1.14%，表明該方法精密度較好，滿足測(cè)定要求。

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取編號(hào)為16 的皺皮木瓜細(xì)粉6 份，每份約0.5 g，分別加入適量的齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表5。由表5 可知，齊墩果酸、熊果酸加標(biāo)回收率分別為96.10%～99.15%、95.50～99.07%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表5 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

分別取編號(hào)為1～18 的木瓜細(xì)粉各約1.0 g，按1.4 方法制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 木瓜樣品中熊果酸、齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果 %

由表6 可知，皺皮木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸總含量為0.41%～0.87%，不同產(chǎn)地的皺皮木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸總含量存在較大差異，四川的樣品含量較高?！吨袊?guó)藥典》2020 年版一部木瓜藥材含量規(guī)定，齊墩果酸和熊果酸總量不得少于0.50%，按此限度有2 批樣品不合格。光皮木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量較低，總量?jī)H為0.20%，其中熊果酸含量較高，因此建議皺皮木瓜飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有必要增加齊墩果酸、熊果酸含量測(cè)定項(xiàng)目。

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法測(cè)定皺皮木瓜飲片中齊墩果酸、熊果酸含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于皺皮木瓜飲片的質(zhì)量控制。采用所建方法對(duì)不同產(chǎn)地皺皮木瓜飲片進(jìn)行測(cè)定，齊墩果酸、熊果酸含量存在較大差異，皺皮木瓜質(zhì)量狀況整體較好。