訾玉祥,陸兆新,呂風(fēng)霞,別小妹,張充,趙海珍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

體內(nèi)氧化反應(yīng)被證明與諸多疾病的發(fā)生有關(guān)[1]。研究表明,機(jī)體內(nèi)過剩的自由基會使氧化壓力升高,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[2-5],而抗氧化活性物質(zhì)可以起到清除體內(nèi)自由基,防止氧化反應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞損傷。因此,從自然界中獲取具有抗氧化作用的物質(zhì)并探討其活性構(gòu)效關(guān)系對于防止機(jī)體氧化損傷具有重要意義。

紫蘇(Perillafrutescens)屬唇形科草本植物,作為國家衛(wèi)生健康委員會第一批規(guī)定的藥食同用的60種作物之一,其在食品藥品領(lǐng)域具有重要的開發(fā)價值,在國內(nèi)外受到廣泛的關(guān)注[6]。紫蘇提取物具有優(yōu)良的抗氧化作用[7]。Sugawara等[8]研究表明紫蘇中甘油糖脂含量豐富,是獲取甘油糖脂的重要植物來源。甘油糖脂是一種天然來源的或人工合成的具有多種活性作用的脂類物質(zhì),因其具有安全可靠、對人體無不良副作用的優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于食品、藥品及保健品之中。從微桿菌Microbacteriumsp. M874和棒狀桿菌CorynebacteriumaquaticumS365 中分別分離出2種不同分子結(jié)構(gòu)的甘油糖脂,發(fā)現(xiàn)它們可以通過阻止叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化死亡、清除羥自由基及過氧化氫自由基起到優(yōu)良的抗氧化作用[9-12]。已從重要經(jīng)濟(jì)作物紫蘇中分離得到的3種不同分子結(jié)構(gòu)甘油糖脂[13],但其是否具有抗氧化作用目前仍不清楚。研究表明,甘油糖脂的分子構(gòu)成,如糖基的類型、脂肪?；逆滈L及不飽和雙鍵的數(shù)量、脂肪?；倪B接位點等對其生物活性有著重要影響[14-19]。本試驗通過化學(xué)評價法及細(xì)胞氧化損傷模型評估紫蘇中3種不同分子結(jié)構(gòu)甘油糖脂的抗氧化活性,并初步探討其分子構(gòu)效與生物活性之間的關(guān)系,旨在為開發(fā)新型抗氧化活性物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘油糖脂從干制紫蘇葉(產(chǎn)自上海)中分離所得;巨噬細(xì)胞RAW264.7由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

DMEM完全培養(yǎng)基購于美國Mediatech公司;細(xì)胞消化液、脂多糖(LPS)、PBS緩沖液、噻唑藍(lán)(MTT)溶液、細(xì)胞凍存液和胰蛋白酶均購于 Gibco 公司;6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鄰菲啰啉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、羥自由基測定試劑盒、超氧陰離子測定試劑盒以及CAT、SOD和GSH-Px檢測試劑盒均購于南京建成生物技術(shù)有限公司;過硫酸鉀、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵和無水乙醇均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(北京)。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112B超凈工作臺購于上海智城分析儀器制造有限公司;TS100-F倒置相差顯微鏡購于日本Nikon公司;HFU 586 Basic二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司;LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器購于上海申安醫(yī)療器械廠;TDL-50C低速臺式離心機(jī)購于上海安亭科學(xué)儀器廠;TS-200振蕩儀購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司;HH-2恒溫水浴鍋購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫蘇葉中甘油糖脂的提取及鑒定通過硅膠柱層析、薄層色譜、半制備液相色譜等分離純化方法從紫蘇葉中獲取甘油糖脂。主要提取步驟:利用氯仿/甲醇混合液對紫蘇葉中的總脂進(jìn)行提取,將總脂施加到硅膠柱中,通過硅膠柱層析梯度洗脫法分離甘油糖脂單體,使用薄層色譜對甘油糖脂進(jìn)行定性分析,最后利用半制備液相色譜對甘油糖脂進(jìn)行二次純化,最終獲得高純度的甘油糖脂單體。采用質(zhì)譜法、核磁波譜法對甘油糖脂的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1.3.2 甘油糖脂的DPPH清除能力測定采用Oliveira Neto等[20]的方法并略作修改。準(zhǔn)確配制0.08 mmol·L-1DPPH儲備液,置于4 ℃冰箱中備用。使用無水乙醇配制不同質(zhì)量濃度梯度(125、250、500、1 000 和 2 000 μg·mL-1)的甘油糖脂樣品,取100 μL甘油糖脂樣品和100 μL DPPH儲備液混勻,避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測定其吸光值記為A1;空白對照組為不含有甘油糖脂的DPPH乙醇液(100 μL乙醇+100 μL DPPH),吸光值記為A0;以對應(yīng)質(zhì)量濃度的Trolox(125、250、500、1 000和2 000 μg·mL-1)作為陽性對照。每組設(shè)置3個平行試驗。DPPH自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%。

1.3.3 甘油糖脂的ABTS清除能力測定采用Zheng等[21]的方法并略作修改。將過硫酸鉀儲備液(2.45 mmol·L-1)與ABTS儲備液(7 mmol·L-1)按1∶1體積比配制ABTS預(yù)備液,用0.1 mol·L-1PBS緩沖液稀釋ABTS預(yù)備液至734 nm處吸光值為0.7,獲得ABTS工作液。配制甘油糖脂樣品質(zhì)量濃度為16、32、64、128、256和512 μg·mL-1;取50 μL甘油糖脂樣品液與150 μL ABTS工作液混勻,避光反應(yīng)30 min,于 734 nm 處測定其吸光值,記為A1;空白對照組為不含有甘油糖脂ABTS工作液(50 mL PBS+150 μL ABTS),吸光值記為A0;以Trolox(16、32、64、128、256和512 μg·mL-1)作為陽性對照。每組設(shè)置3個平行試驗。ABTS自由基清除率=(1-A1/A0)×100%。

1.3.4 羥自由基和超氧陰離子清除能力測定配制不同質(zhì)量濃度(125、250、500、1 000和2 000 μg·mL-1)甘油糖脂樣品溶液,以對應(yīng)質(zhì)量濃度的Trolox(125、250、500、1 000和2 000 μg·mL-1)溶液作為陽性對照。按照南京建成生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒操作說明書,測定管吸光值,記為Ai,對照管記為Aj,空白管記為A0。每組設(shè)置3個平行試驗。羥自由基清除率或超氧陰離子自由基清除率=(Ai-Aj)/(A0-Aj)×100%。

1.3.5 甘油糖脂還原力測定采用李慧[22]的方法并略有修改。取50 μL不同質(zhì)量濃度(125、250、500、1 000 和2 000 μg·mL-1)甘油糖脂樣品液、50 μL 0.2 mol·L-1PBS緩沖液(pH7.0)和50 μL 10 g·L-1鐵氰化鉀溶液于50 ℃水浴鍋中加熱20 min。反應(yīng)結(jié)束后室溫冷卻,加入50 μL 100 g·L-1三氯乙酸室溫反應(yīng) 15 min,最后加入50 μL ddH2O和50 μL 1 g·L-1三氯化鐵溶液,靜置10 min,于700 nm處測定其吸光值。以PBS緩沖液作為空白對照,以Trolox(125、250、500、1 000、2 000 μg·mL-1)作為陽性對照。每組設(shè)置 3個平行試驗。

1.3.6 超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性測定細(xì)胞培養(yǎng)參考Li[23]的方法并略作修改。采用LPS作為刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7發(fā)生氧化損傷的誘導(dǎo)劑。取細(xì)胞(1×105mL-1)于24孔板中,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;棄去培養(yǎng)上清液,加入1 μg·mL-1LPS和不同質(zhì)量濃度(10、500、1 000 μg·mL-1)的甘油糖脂樣品于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h。以Trolox(500 μg·mL-1)作為陽性對照,以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基為空白對照。每組設(shè)置5個平行。培養(yǎng)結(jié)束后,使用PBS清洗板孔,再向內(nèi)加入胰蛋白酶液、細(xì)胞組織快速裂解液,4 ℃,14 000g離心10 min,收集上清液,按照試劑盒操作方法測定細(xì)胞中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶相對活性,測定管吸光值記為A1,空白管記為A0。酶相對活性=A1/A0。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用 SAS system V8 對測定結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和t測驗,比較0.05水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇葉中甘油糖脂的分子結(jié)構(gòu)

通過硅膠柱層析及半制備液相色譜法從紫蘇葉中分離純化獲得3種甘油糖脂單體:1個單半乳糖基甘油二酯MGDG(C18∶3/C18∶3),2個雙半乳糖基甘油二酯DGDG(C18∶3/C18∶3)和DGDG(C18∶3/C16∶0),經(jīng)質(zhì)譜及核磁波譜法分析鑒定結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 紫蘇葉中甘油糖脂的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of glycoglycerolipids from perilla leavesA. MGDG(C18∶3/C18∶3):1,2-2-O-(9,12,15-亞麻?；?-3-O-(β-D-半乳糖基)-sn-甘油1,2-2-O-(9Z,12Z,15E-octadecatrienoyl)-3-O-(β-D-galactopyranosy)-sn-glycerol;B. DGDG(C18∶3/C18∶3):1-O-(9,12,15-亞麻酰基)-2-O-(6,9,12-亞麻?；?-3-O-[β-D-半乳糖基-α-D-半乳糖基]-sn-甘油1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z-octadecatrienoyl)-3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1′→6″)-α-D-galactopyranosyl]-sn-glycerol;C. DGDG(C18∶3/C16∶0):1-O-(9,12,15-亞麻酰基)-2-O-軟脂?；?3-O-[β-D-半乳糖基-α-D-半乳糖基]-sn-甘油1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-hexadecanoyl-3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1″→6′)-α-D-galactopyr ranosyl]-sn-glycerol.

2.2 基于化學(xué)評價法分析紫蘇葉中甘油糖脂的抗氧化能力

2.2.1 甘油糖脂的自由基清除能力由圖2可見:隨著甘油糖脂質(zhì)量濃度的增加,對自由基的清除能力也隨之增加,呈良好的量效關(guān)系。MGDG(C18∶3/C18∶3)、DGDG(C18∶3/C18∶3)和DGDG(C18∶3/C16∶0)對DPPH自由基最大清除率分別為63.06%、60.63%和30.36%,對ABTS自由基最大清除率分別為 85.10%、80.21%和72.36%。相同質(zhì)量濃度下,MGDG(C18∶3/C18∶3)的清除能力明顯高于其他單體。

圖2 不同質(zhì)量濃度甘油糖脂的DPPH 和ABTS 自由基清除率Fig.2 The scavenging rate of different concentrations of glycoglycerolipids on DPPH and ABTS

圖3 不同質(zhì)量濃度甘油糖脂的羥自由基和超氧陰離子自由基清除率Fig.3 The scavenging rate of different concentrations of glycoglycerolipids on ·OH and

2.2.3 甘油糖脂的還原能力如圖4所示:3種甘油糖脂均具有較強(qiáng)的還原能力,且還原能力隨著甘油糖脂質(zhì)量濃度的增加而不斷升高。同等質(zhì)量濃度下,不同分子結(jié)構(gòu)甘油糖脂的還原能力也有所不同。當(dāng)甘油糖脂為125～250 μg·mL-1時,MGDG的還原能力與DGDG差異顯著(P<0.05),而不同脂肪?；鶚?gòu)成的DGDG之間的還原能力無顯著差異(P>0.05);當(dāng)甘油糖脂為500～2 000 μg·mL-1時,3種甘油糖脂之間的還原能力差異顯著。當(dāng)甘油糖脂為2 000 μg·mL-1時,MGDG(C18∶3/C18∶3)、DGDG(C18∶3/C18∶3)和DGDG(C18∶3/C16∶0)的最大吸光值分別達(dá)到1.01、0.54和0.27,由此可知,還原能力最強(qiáng)的為MGDG(C18∶3/C18∶3),但顯著低于陽性對照Trolox。

圖4 紫蘇葉中不同質(zhì)量濃度甘油糖脂的總還原力Fig.4 Total reducing power of different concentrations of glycoglycerolipids in perilla leaves不同小寫字母表示不同甘油糖脂間差異顯著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters above the bars represent the tested values are significantly different(P<0.05)in different glycoglycerolipids. The same as follows.

2.3 基于細(xì)胞氧化損傷模型評價甘油糖脂的抗氧化能力

通過建立細(xì)胞氧化損傷模型考察甘油糖脂對抗氧化酶活性的影響,進(jìn)一步判斷紫蘇葉中甘油糖脂的抗氧化能力。如圖5所示:與空白對照組相比,脂多糖(LPS)誘導(dǎo)組明顯降低了細(xì)胞的3種抗氧化酶活性。3種抗氧化酶活性隨著甘油糖脂質(zhì)量濃度的增加而提高,并具有一定的質(zhì)量濃度相關(guān)性。與LPS誘導(dǎo)組相比,中質(zhì)量濃度(500 μg·mL-1)和高質(zhì)量濃度(1 000 μg·mL-1)的3種甘油糖脂均顯著提高了細(xì)胞的抗氧化酶活性;低質(zhì)量濃度(10 μg·mL-1)中,MGDG(C18∶3/C18∶3)處理組的3種細(xì)胞抗氧化酶活性顯著提高。低質(zhì)量濃度DGDG(C18∶3/C18∶3)可以有效抵御由LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞SOD活性的下降,而對CAT及GSH-Px活性無顯著提高作用;低質(zhì)量濃度 DGDG(C18∶3/C16∶0)對由LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞SOD及GSH-Px活性降低有顯著改善作用,但未能抵抗細(xì)胞氧化損傷所導(dǎo)致的CAT活性下降。相同質(zhì)量濃度(500 μg·mL-1)的3種甘油糖脂對抗氧化酶活性的提升作用均顯著低于Trolox,其中MGDG(C18∶3/C18∶3)單體的活性最強(qiáng)。

圖5 不同質(zhì)量濃度甘油糖脂對抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of glycoglycerolipids on antioxidant enzyme activity

3 討論

由上述研究結(jié)果表明,隨著糖基數(shù)量的增加,甘油糖脂的抗氧化活性減弱；而糖基數(shù)量一定時,脂?；鶠殡p亞麻酰基(C18∶3/C18∶3)的甘油糖脂的抗氧化活性大于脂?；鶠閬喡轷；?軟脂?；?C18∶3/C16∶0)的甘油糖脂,說明脂?；疤腔鶖?shù)量對甘油糖脂類化合物的抗氧化活性影響比較大。Matsufuji等[12]分別研究了由1個半乳糖基和2個半乳糖基組成的甘油糖脂單體的抗氧化活性,它們的脂?；糠志鶠殚L鏈飽和脂肪酸,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種糖脂單體均能保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境中氧自由基的入侵,防止細(xì)胞因氧化損傷導(dǎo)致的細(xì)胞分化,且單個半乳糖組成的甘油糖脂的抗氧化活性強(qiáng)于2個半乳糖組成的甘油糖脂單體,本研究結(jié)果與之相一致。蔣志國[24]對南瓜中的6種甘油糖脂的抗氧化活性及構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)6種不同糖基及脂?；M成的糖脂單體均具有清除DPPH自由基的能力;構(gòu)效關(guān)系研究表明糖基構(gòu)型(α,β構(gòu)型)及脂?；牟伙柡投葘寡趸钚杂绊戄^大,如果分子中僅存在α及β構(gòu)型半乳糖,糖基數(shù)量一定時,脂?；鶠閬喡樗?C18∶3)的甘油糖脂抗氧化活性強(qiáng)于脂?；鶠閬営退?C18∶2)的甘油糖脂,本試驗中不飽和度較高的DGDG(C18∶3/C18∶3)的抗氧化活性也高于不飽和度相對較低的DGDG(C18∶3/C16∶0)。另外,研究人員也對甘油糖脂的抗病毒、免疫抑制及抗腫瘤等活性構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究,例如Pongmuangmul等[25]對MGDG和DGDG的抗病毒作用進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),具有無細(xì)胞毒性作用的MGDG分子對病毒的半抑制濃度為36.00 μg·mL-1,低于DGDG的半抑制濃度(43.20 μg·mL-1);Dai等[26]研究結(jié)果表明,含有硬脂酰基(C18∶0)的硫酸奎諾酮甘油二酯(SQDG)的免疫抑制作用強(qiáng)于含有軟脂?；?C16∶0)的SQDG,表明脂肪?；兼滈L度對甘油糖脂的抗氧化活性可能也具有一定的影響;Colombo等[18]對甘油糖脂抗腫瘤的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)影響甘油糖脂的抗腫瘤活性強(qiáng)弱的最關(guān)鍵因素在于脂?；湹拈L度,而與糖基種類及脂?；恢玫年P(guān)系并不是很明顯。由于本文中甘油糖脂的結(jié)構(gòu)僅在糖基數(shù)量及脂肪?；伙柡投壬洗嬖诓町?而甘油糖脂中糖基的種類、構(gòu)型及脂?；c甘油基團(tuán)的連接位點是否對其抗氧化活性具有影響則有待后續(xù)進(jìn)一步研究。