婁 越，陳 丹，常亞青，叢玉婷，王連順，李丹彤

( 大連海洋大學，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)，又稱大連紫海膽，屬棘皮動物門、海膽綱、球海膽科，為中國主要海膽類養(yǎng)殖經(jīng)濟物種[1]。作為我國可食用和藥用的海膽種類之一，光棘球海膽的養(yǎng)殖相關(guān)問題逐漸成為試驗研究的重點[2-3]。目前海膽?zhàn)B殖病害防治的主要方法是抗菌素治療，但過度使用抗生素會導(dǎo)致細菌產(chǎn)生抗藥性[4]。因此研究光棘球海膽免疫機制，有助于海膽類生物病害防治機理研究。

棘皮動物只有非特異性免疫系統(tǒng)，由體腔細胞和體液免疫因子組成，吞噬細胞為其中重要的一種[5]。機體內(nèi)起到促進吞噬作用的物質(zhì)總稱為調(diào)理素，能夠幫助吞噬細胞吞噬和清除抗原抗體[6]，構(gòu)筑體內(nèi)免疫防線。目前，已在貝類[7]、海星[8]、海膽[9]和海參[10]等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中證實了在病原體周圍有促進吞噬作用的物質(zhì)存在。麥康森等[11]在對仿刺參(Apostichopusjaponicus)體腔液的研究中發(fā)現(xiàn)，調(diào)理素樣分子在機體受到免疫刺激時分子水平會增加。張穎等[12]在蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotusintermedius)體腔液中發(fā)現(xiàn)了分子質(zhì)量為250.62 ku的調(diào)理素樣分子。張揚等[13]在長牡蠣(Crassostreagigas)中分離出一種新型貝類調(diào)理素DCP，具有強烈的促進血淋巴細胞吞噬的作用。目前光棘球海膽體腔液調(diào)理素的相關(guān)研究較少。

筆者測定在不同反應(yīng)基質(zhì)中等量光棘球海膽吞噬細胞對不同處理的酵母細胞的吞噬率，比較分析從受調(diào)理酵母細胞和非調(diào)理酵母細胞以及光棘球海膽無細胞體腔液這3種成分中提取分離出來的樣品的電泳結(jié)果，提取收集光棘球海膽無細胞體腔液調(diào)理素樣分子并進行功能測定。對光棘球海膽調(diào)理素樣分子的試驗，有利于研究其免疫機制，為進一步實現(xiàn)光棘球海膽的病害防治和健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

光棘球海膽購于大連黑石礁早市，平均體質(zhì)量(80.9±1.9) g，海水溫度15～18 ℃，16頭光棘球海膽于大連海洋大學重點實驗室100 cm×50 cm×60 cm 30 L充氣水槽中養(yǎng)殖7 d后進行試驗，每日換水1次。

1.1.2 酵母細胞懸液[14]

將100 mg酵母懸于0.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，沸水浴加熱30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗后4000 r/min離心10 min，過程中磷酸鹽緩沖液的添加量需低于離心管的2/3，沖洗離心6次，磷酸鹽緩沖液稀釋至體積比為1∶90。

1.1.3 吞噬細胞

用注射器從新鮮光棘球海膽的圍口腔內(nèi)抽取7～8 mL體腔液加入離心管，再加入等體積的無菌海水后1000 r/min離心5 min，取其沉淀加入1 mL無菌海水稀釋，顯微鏡觀察確保有吞噬細胞存在，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.4 光棘球海膽無細胞體腔液、調(diào)理素樣分子

用0.22 μm的濾膜過濾抽取出來的光棘球海膽體腔液至少5遍，取10 μL在顯微鏡下觀察，直到吞噬細胞被全部過濾掉，即為光棘球海膽無細胞體腔液，放在4 ℃冰箱保存，用透析膜透析60 h，之后通過平衡過的葡聚糖G-200柱進行層析，收集調(diào)理素樣分子。

1.1.5 酵母細胞吸附的無細胞體腔液、受調(diào)理的酵母細胞

3.5 mL酵母細胞懸液和3 mL無細胞體腔液混合，常溫培養(yǎng)1 h，8000 r/min離心10 min,得到的沉淀是吸附了調(diào)理素的酵母細胞，上清液是經(jīng)酵母細胞吸附過調(diào)理素的光棘球海膽無細胞體腔液。將下層沉淀換到小離心管中，再進行一次離心后得到受調(diào)理的酵母細胞。

1.2 方法

1.2.1 不同反應(yīng)基質(zhì)對光棘球海膽吞噬細胞吞噬活性影響的測定

試驗分4組進行，前3組分別在2 mL光棘球海膽吞噬細胞里加2 mL磷酸鹽等滲緩沖液、經(jīng)酵母細胞吸附過的無細胞體腔液和光棘球海膽無細胞體腔液，每組各加入1 mL酵母細胞懸液；第4組在2 mL光棘球海膽吞噬細胞里加2 mL等滲緩沖液和1 mL受調(diào)理酵母細胞；4組均于常溫培養(yǎng)2 h，多次振蕩試管后，顯微鏡下觀察并測定不同的反應(yīng)基質(zhì)里等量光棘球海膽吞噬細胞對不同處理的酵母細胞的吞噬率。每完成1次計數(shù)后再換1組海膽抽取體腔液，再重復(fù)上述試驗2次。

吞噬率為100個吞噬細胞中吞噬酵母細胞數(shù)的百分比[15]。

1.2.2 樣品的制備及SDS-PAGE分析

制備3種樣品并進行SDS-PAGE分析[16]。制備出受調(diào)理酵母細胞所提取的里面含有調(diào)理素樣分子成分的樣品：0.5～1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液洗滌受調(diào)理酵母細胞后，加200 μL 1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)，在沸水浴加熱5 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液；制備出非調(diào)理酵母細胞所提取的不含調(diào)理素樣分子成分的樣品：0.5～1.0 mL磷酸鹽緩沖溶液洗滌非調(diào)理的酵母細胞后，加200 μL 1%十二烷基硫酸鈉，在沸水浴加熱5 min，4000 r/min離心5 min，收集上清液；制備其中含有調(diào)理素樣分子成分的光棘球海膽無細胞體腔液的樣品。3種樣品分別進行電泳后，染色1 h，清洗3次，最后加脫色液。

1.2.3 調(diào)理素樣分子的純化及SDS-PAGE分析

用截留分子量3.5 ku的透析膜將抽取出來的光棘球海膽體腔液在4 ℃冰箱透析60 h，每隔15 h換透析液1次，之后通過平衡過的葡聚糖G-200柱(1.6 cm×90 cm)進行層析[17]，3.0 mL/10 min流速加緩沖液洗脫，280 nm紫外分光檢測，對峰值進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 調(diào)理素樣分子功能的測定

分別加入2.0、1.5、1.0、0.5 mL等滲緩沖液，再分別加入0、0.5、1.0、1.5 mL經(jīng)純化的調(diào)理素樣分子, 每支試管中再加1.0 mL吞噬細胞和1.0 mL酵母細胞懸液,15 min振蕩1次，使其完全混勻，室溫培養(yǎng)2 h，用顯微鏡測定吞噬率。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗，結(jié)果表示為平均值±標準差，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)基質(zhì)里光棘球海膽吞噬細胞的吞噬率

光棘球海膽吞噬細胞分別在等滲緩沖液、經(jīng)酵母細胞吸附過無細胞體腔液、光棘球海膽無細胞體腔液對非調(diào)理的酵母細胞和在等滲緩沖液中對受調(diào)理的酵母細胞的吞噬率之比為1.00∶1.17∶2.00∶1.71，對照組與其他3個試驗組均有極顯著差異(P<0.01)，這表明光棘球海膽體腔液中可能存在某種調(diào)理素樣分子，能夠提高吞噬細胞吞噬活性，其中等滲緩沖液中光棘球海膽的吞噬細胞對受調(diào)理的酵母細胞的吞噬率是對非調(diào)理的酵母細胞的1.71倍，這可能是光棘球海膽體腔液的調(diào)理素樣分子被吸附在酵母細胞表面，從而增強了吞噬作用(圖1)。

圖1 不同反應(yīng)基質(zhì)吞噬細胞的吞噬率Fig.1 The rate of phagocytosis in different reaction media 1.PBS等滲緩沖溶液+非調(diào)理酵母細胞； 2.經(jīng)酵母吸附的無細胞體腔液+非調(diào)理酵母細胞； 3.無細胞體腔液+非調(diào)理酵母細胞； 4.PBS等滲緩沖溶液+受調(diào)理酵母細胞. 1.the PBS isotonic buffer + no regulating yeast cells； 2.the cell free coelomic fluid by yeast cell adsorption + no regulating yeast cells； 3.the cell free coelomic fluid+no regulating yeast cells； 4.the PBS isotonic buffer + regulating yeast cells.

2.2 SDS-PAGE分析

將3種提取出的樣品進行電泳，受調(diào)理酵母細胞提取出的含調(diào)理素樣分子成分的樣品在200.00 ku下方顯示為1個明顯條帶(圖2a)。非調(diào)理酵母細胞提取出的不含調(diào)理素樣分子成分的樣品，其對應(yīng)位置并沒有顯示出條帶(圖2b)，含調(diào)理素樣分子的光棘球海膽無細胞體腔液成分，在200.00 ku下方同樣顯示出一個明顯的條帶，由于光棘球海膽無細胞體腔液內(nèi)除了調(diào)理素樣分子之外還有其他的蛋白質(zhì)，因此有多個條帶(圖2c)。由此可見，光棘球海膽體腔液應(yīng)該存在某種調(diào)理素樣分子，能夠被酵母細胞吸附(圖2)。通過測定電泳圖相對遷移率，得出分子質(zhì)量約為149 ku(圖3)。

圖2 光棘球海膽體腔液調(diào)理素樣分子的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of opsonin-like molecule in coelomic fluid of sea urchin S. nudus M.蛋白質(zhì)marker；a.受調(diào)理酵母細胞提取的成分； b.非調(diào)理酵母細胞提取的成分； c.光棘球海膽無細胞體腔液. M.protein marker;a.the composition seperated from regulating yeast cells; b.the composition seperated from no regulating yeast cells; c.no cell coelomic fluid of sea urchin S. nudus.

圖3 Marker的分子質(zhì)量標準曲線Fig.3 Molecular weight standard curve of marker

2.3 調(diào)理素樣分子純化結(jié)果

光棘球海膽無細胞體腔液經(jīng)透析和SephadexG-200凝膠過濾層析，收集流下來的50管液體中紫外分光檢測出現(xiàn)1個峰值(圖4)，其峰值樣品的電泳顯示，200.00 ku下方呈現(xiàn)為1個明顯條帶(圖5)。測定電泳圖相對遷移率，得出分子質(zhì)量約為156 ku(圖6)。

圖5 純化的調(diào)理素樣分子的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified opsonin-like molecule in celll-free coelomic fluid of sea urchin S. nudus M.蛋白質(zhì)marker；a.30 μL純化調(diào)理素樣分子； b.40 μL純化調(diào)理素樣分子； c.50 μL純化調(diào)理素樣分子. M.protein marker;a.30 μL purified opsonin-like molecule; b.40 μL purified opsonin-like molecule; c.50 μL purified opsonin-like molecule.

圖6 Marker的分子質(zhì)量標準曲線Fig.6 Molecular weight standard curve of marker

2.4 調(diào)理素樣分子的功能測定分析

將光棘球海膽無細胞體腔液經(jīng)過提取分離后得到調(diào)理素樣分子，等滲緩沖溶液中，測定其在不同添加量不同時間點，對光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性的影響程度。試驗結(jié)果表明，添加0.5、1.0、1.5 mL經(jīng)純化調(diào)理素樣分子的試驗組的吞噬率均高于對照組(圖7)。反應(yīng)開始15、30、45、60 min 4個時間點分別測定3種不同添加量的調(diào)理素樣分子對光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性的影響結(jié)果(圖8)。提取的光棘球海膽體腔液調(diào)理素樣分子能夠明顯提高光棘球海膽吞噬細胞的吞噬能力，反應(yīng)60 min時，0.5、1.0 mL和1.5 mL組與對照組均有極顯著差異(P<0.01)，調(diào)理素樣分子含量越高，越能促進光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性。

圖7 不同添加量調(diào)理素樣分子溶液中吞噬細胞的吞噬率Fig.7 The rate of phagocytosis of opsonin-like molecule in different addition amount

圖8 各時間點含調(diào)理素樣分子的溶液中吞噬細胞的吞噬率Fig.8 The rate of phagocytosis in opsonin-like molecule fluid at different time

3 討 論

3.1 光棘球海膽調(diào)理素樣分子的免疫機制

棘皮動物沒有專門的循環(huán)器官，通過體腔膜細胞的纖毛擺動在體腔液中進行營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，體腔液中的體腔細胞具有吞噬作用。調(diào)理素樣分子是能夠促進吞噬細胞作用的一種蛋白質(zhì)，是一條連接吞噬細胞和異物的“橋梁”[18]，在棘皮動物免疫系統(tǒng)中是重要的一部分。通過對光棘球海膽的體腔吞噬細胞在不同基質(zhì)里吞噬率的不同，證明了光棘球海膽體腔液中存在刺激吞噬細胞作用的調(diào)理素樣分子，能夠標記酵母細胞，增強吞噬細胞活性，從而調(diào)節(jié)免疫的進程。

本試驗中，提取的光棘球海膽體腔液調(diào)理素樣分子的分子質(zhì)量約為156 ku，與張穎等[12]在蝦夷馬糞海膽體腔液中提取出的調(diào)理素樣分子分子質(zhì)量(250.62 ku)不同。在等滲緩沖液、經(jīng)酵母細胞吸附過無細胞體腔液以及光棘球海膽無細胞體腔液這3種不同反應(yīng)基質(zhì)，本試驗結(jié)果與已有研究結(jié)果一致，光棘球海膽的無細胞體腔液基質(zhì)吞噬率最高，可知其中存在某種調(diào)理素樣分子和未知物質(zhì)，共同促進吞噬細胞的吞噬作用。在等滲緩沖溶液光棘球海膽吞噬細胞對非調(diào)理和受調(diào)理酵母細胞的吞噬能力有差異，是由于在受調(diào)理酵母細胞表面吸附了某種調(diào)理素樣分子，能起到增強吞噬細胞活性的作用。

3.2 調(diào)理素樣分子的純化

調(diào)理素在外來物質(zhì)入侵生物時對其進行標記，幫助生物機體的吞噬細胞能夠精準識別并清除外來物質(zhì)。國內(nèi)外研究表明，已在多種海參、海膽[11-12]的體腔液中發(fā)現(xiàn)調(diào)理素的存在，并通過透析和層析提取出調(diào)理素樣分子進行了功能測定。筆者將這方面研究較少的光棘球海膽作為試驗對象，從受調(diào)理酵母細胞和非調(diào)理酵母細胞以及光棘球海膽無細胞體腔液這3種不同成分提取的樣品進行SDS-PAGE分析，其結(jié)果再次確定了光棘球海膽體腔液中有調(diào)理素樣分子的存在，調(diào)理素樣分子能夠吸附于酵母細胞的表面，含調(diào)理素樣分子成分的樣品進行電泳時均在200.00 ku下方顯示有1個明顯條帶。

對光棘球海膽體腔液調(diào)理素樣分子進行提取純化的試驗過程，參考了刺參凝集素[19]和蝦夷馬糞海膽體腔液調(diào)理素[12]的提取工藝。將光棘球海膽無細胞體腔液用透析膜在4 ℃冰箱透析60 h，之后通過平衡過的葡聚糖G-200柱進行層析，小管收集流下來的液體，用紫外分光光度計在280 nm下進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液體對光的吸收度出現(xiàn)1個峰值，峰值處即為純化的調(diào)理素樣分子，進行電泳分析后得出其分子質(zhì)量約為156 ku，說明光棘球海膽體腔液內(nèi)調(diào)理素樣分子的分子質(zhì)量約為156 ku。

3.3 光棘球海膽調(diào)理素樣分子的功能性質(zhì)

調(diào)理素是生物體內(nèi)一類促進吞噬作用的蛋白質(zhì)，能夠幫助清除體內(nèi)的病原體，參與炎癥反應(yīng)[20]，維持體腔液環(huán)境穩(wěn)態(tài)[21]。目前對調(diào)理素的相關(guān)試驗不斷進行，已經(jīng)在多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中發(fā)現(xiàn)了促進吞噬作用的物質(zhì)存在[7-10]。筆者通過測定光棘球海膽吞噬細胞在不同介質(zhì)里對不同處理的酵母細胞的吞噬率，確定了光棘球海膽體腔液中有增強吞噬細胞活性的物質(zhì)存在，經(jīng)過透析和層析將調(diào)理素樣分子提取純化出來，計算得出其分子質(zhì)量約為156 ku。

將純化的光棘球海膽調(diào)理素樣分子進行功能測定，在反應(yīng)開始15、30、45、60 min 4個時間點測定分別添加0.5、1.0、1.5 mL的調(diào)理素樣分子對光棘球海膽吞噬細胞的吞噬活性的影響程度。等滲緩沖溶液中，在一定添加量范圍內(nèi)，4個時間點調(diào)理素樣分子添加量越高，光棘球海膽吞噬細胞的吞噬率越大。說明光棘球海膽體腔液的調(diào)理素樣分子能增強吞噬細胞的吞噬活性，幫助吞噬細胞對體腔液外來物質(zhì)進行清除，并且調(diào)理素樣分子的添加量能夠影響吞噬進程，一定范圍內(nèi)，當添加量增加時，能夠刺激更多的體腔吞噬細胞參與免疫反應(yīng)。