韓立軍，劉萌萌，劉寶玲，王志龍，薛金愛，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）廣泛存在于動植物及真菌中，屬氧化還原酶，是一種含非血紅素鐵的蛋白，酶蛋白由單肽鏈組成，專一催化具有順，順-1，4 戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)[1]。在植物中，LOX 的作用底物主要是亞油酸和亞麻酸[2]，其中，9-LOX 和13-LOX 分別能夠催化底物生成9S- 氫過氧化十八碳二烯酸（9-HPOD）和13S- 氫過氧化十八碳二烯酸（13-HPOD），之后又經(jīng)過一系列代謝途徑和酶促反應(yīng)，最終生成氧脂素（Oxylipins）[3]，氧脂素可增強(qiáng)植物抗逆性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，LOX具有促進(jìn)種子萌發(fā)過程中儲藏脂質(zhì)（TAG）的降解、調(diào)控植物營養(yǎng)器官的生長發(fā)育、增強(qiáng)植物抵抗生物與非生物脅迫以及產(chǎn)生植物特有香氣等功能[5]。LOX 是茉莉酸（JA）合成途徑中的第1 個關(guān)鍵酶[6-7]，進(jìn)而誘導(dǎo)抗逆基因表達(dá)以抵御環(huán)境脅迫。研究還發(fā)現(xiàn)，LOX 基因在植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等組織中均有差異表達(dá)[8]；番茄中14 個LOX 在熱、冷、干旱、鹽4 種非生物脅迫下呈現(xiàn)出不同的表達(dá)量[9]，其中，冷脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。

棉花是我國重要的纖維作物和油料作物，在我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有不可或缺的作用[10]。研究表明，棉花起源于亞熱帶，適合生長在溫暖的氣候環(huán)境中，而在我國北方棉區(qū)，氣候寒涼，在棉花生長早期可能會遇到倒春寒等低溫天氣，不僅會使植物細(xì)胞膜流動性減弱，細(xì)胞通透性增大，導(dǎo)致內(nèi)容物流失，嚴(yán)重影響棉花發(fā)育，而且會造成植物死亡[11-13]；同時棉花幼苗易受真菌感染，最終影響棉花產(chǎn)量和棉纖維品質(zhì)。因此，探究棉花應(yīng)對冷脅迫的響應(yīng)機(jī)制對我國棉花生產(chǎn)與安全具有重要意義。

陸地棉（Gossypium hirsutumL.）是異源四倍體（4n＝52），由A 基因組和D 基因組組成[14-15]。本研究基于已經(jīng)公布的棉花基因組數(shù)據(jù)，對GhLOX家族基因進(jìn)行鑒定，對其基因結(jié)構(gòu)、氨基酸理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對GhLOX家族基因在不同組織和不同非生物脅迫下的差異表達(dá)模式進(jìn)行分析后，進(jìn)一步對部分GhLOX基因在4 ℃冷脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行RT-qPCR 驗證，旨在篩選GhLOX差異基因，為今后GhLOX的功能研究奠定基礎(chǔ)，并為我國棉花安全生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 陸地棉GhLOX 基因家族成員的鑒定、染色體定位和理化性質(zhì)分析

在擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（https://www.arabidopsis.org/）中獲得6 個AtLOX 蛋白序列，在陸地棉數(shù)據(jù)庫CottonFGD（https://cottonfgd.org/）和Phytozomez 數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/）中進(jìn)行BLASTP比對，獲得陸地棉GhLOX 同源蛋白質(zhì)序列，刪除重復(fù)序列，用pfam（http://pfam.xfam.org/）和CDD 進(jìn)一步刪除不含有PLAT（PF01477）和Lipoxygenase（PF00305）結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得陸地棉GhLOX家族成員。利用TBtools 進(jìn)行染色體定位及命名。

利用在線軟件SIB（http://expasy.org/）預(yù)測氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和親水性指數(shù)。使用LocTree3（https://rostlab.org/services/loctree3/）預(yù)測亞細(xì)胞定位。利用在線網(wǎng)站NPSA（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home） 進(jìn)行GhLOX 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2 陸地棉GhLOX 基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

利用在線網(wǎng)站GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）預(yù)測陸地棉LOX 基因結(jié)構(gòu)；利用在線網(wǎng)站MEME（http://meme-suite.org/）預(yù)測陸地棉LOX 基因保守基序，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值，保守基序數(shù)目為12。

1.3 陸地棉GhLOX 家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

在NCBI 中獲得水稻、蘿卜、擬南芥LOX 蛋白序列（表1）。

表1 蘿卜、擬南芥、水稻LOX 基因登錄號

在MAGE 7.0 軟件里采用鄰接方法（Neighborjoining，NJ）對擬南芥、水稻、胡蘿卜和陸地棉LOX蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，抽樣次數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1 000 次。

1.4 陸地棉GhLOX 家族基因的組織特異性及4 種非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

在棉花數(shù)據(jù)庫CottonFGD 中下載陸地棉LOX基因家族在不同組織及冷、熱、鹽、PEG 這4 種脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用軟件TBtools 繪制GhLOX家族基因差異表達(dá)熱圖。

1.5 陸地棉部分基因在4 ℃冷脅迫下的表達(dá)分析

根據(jù)陸地棉GhLOX冷脅迫的熱圖結(jié)果，每個亞家族各選取2 個基因，分別為9-LOX 亞家族的GhLOX-D9.2、GhLOX-D13；13-LOX Ⅰ亞 家 族 的GhLOX-A8.1、GhLOX-D8.1；13-LOXⅡ亞家族的GhLOX-D5、GhLOX-D10，用Primer 6.0 設(shè)計特異性引物（上海生工公司合成引物，表2）。

表2 GhLOX 實(shí)時熒光定量PCR 分析所用引物

取長勢良好且大小一致的陸地棉冀豐1271 的幼苗于4 ℃低溫培養(yǎng)0、1、3、6、12、24、48 h，提取葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以hisone為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR 進(jìn)行差異表達(dá)分析?？偡磻?yīng)體系為10 μL，其中，TB Green 5 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2O3.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃5 min；95 ℃5 s、58 ℃30 s、72 ℃30 s，40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3 次重復(fù)，用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉GhLOX 家族基因成員的鑒定、染色體定位和蛋白理化性質(zhì)分析

通過檢索比對，最終鑒定出22 個GhLOX，根據(jù)染色體位置和順序進(jìn)行命名，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，22 個GhLOX不均勻地分布在15 條染色上，其中，在A 亞組的8 條染色體上（A2、A3、A5、A6、A8、A9、A10、A13）分布著11 個GhLOX基因，在D 亞組的7 條染色體上（D2、D5、D6、D8、D9、D10、D13）分布著11 個GhLOX基因；在A2、A6、A8、D2、D6、D8、D9 這7 條染色體上各有2 個GhLOX基因，其余8 條染色體上均只有1 個GhLOX基因。

對22 個GhLOX家族基因蛋白的理化性質(zhì)分析表明，編碼氨基酸數(shù)目為775～919 個；分子質(zhì)量范圍為87.6～104.15ku；除GhLOX-A3、GhLOX-D2.2、GhLOX-A10、GhLOX-D10 呈堿性外，其余18 個GhLOX 均呈酸性；11 個GhLOX 的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，其余11 個LOX 蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性；親水指數(shù)均為負(fù)值，即均為親水性蛋白；GhLOX-A8.1、GhLOX-A8.2、GhLOXA13、GhLOX-D8.1、GhLOX-D8.2、GhLOX-D13 這6 個LOX 蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，其余16 個均定位在葉綠體中（表3）。

表3 GhLOX 蛋白理化性質(zhì)分析

2.2 陸地棉GhLOX 家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用擬南芥、水稻、蘿卜、陸地棉LOX 蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹如圖2 所示，根據(jù)催化底物時的不同反應(yīng)位置，將GhLOX 蛋白分為9-GhLOX 和13-GhLOX 共2 類，13-GhLOX 亞家族又分為TypeⅠ和TypeⅡ共2 類，其中，TypeⅠ類LOX蛋白序列相似性高達(dá)75%，缺乏葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，TypeⅡ類LOX 蛋白間序列相似性為35%左右，含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽[8]。在GhLOX基因家族中，13-GhLOXⅠ亞家族最大，有9 個基因；13-GhLOXⅡ亞家族最小，有6 個基因；9-GhLOX家族有7 個基因。從進(jìn)化樹中可以看出，陸地棉與蘿卜親緣關(guān)系更近。

2.3 陸地棉GhLOX 基因結(jié)構(gòu)及保守基序的分析

通過對GhLOX編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，大部分氨基酸位點(diǎn)是保守的；由38 個氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域中包含5 個組氨酸（His，H）殘基，其通過形成片段“H-X4-H-X5-H-X17-H-X8-H”來結(jié)合鐵原子（圖3），在LOX 酶發(fā)揮功能時具有重要作用[16-17]。

GhLOX基因家族外顯子數(shù)目為7～10 個，其中，9-GhLOX的基因結(jié)構(gòu)相似，外顯子數(shù)目為8～10 個；13-GhLOX亞家族的基因結(jié)構(gòu)相差較大，且13-GhLOXⅡ相比于13-GhLOXⅠ基因結(jié)構(gòu)相差較大。其中，13 個GhLOX基因同時擁有5′-UTR 和3′-UTR，4 個GhLOX基因只有3′-UTR，1 個GhLOX基因只有5′-UTR，4 個GhLOX基因沒有非翻譯區(qū)。此外，13-LOX 中有3 個基因都含有最長內(nèi)含子，3 個LOX 亞家族表現(xiàn)出了相似的基序排序，除GhLOX -A2.2、GhLOX -A3、GhLOX -A5、GhLOX -D2.2、GhLOX-D5不含有Motif11 外，其余基因均含有Motif1～Motif12，值得注意的是，GhLOX-D5基因含有2 個Motif10（圖4）。

2.4 GhLOX 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析

通過對陸地棉二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，α- 螺旋所占比例為32.16%～40.81%，延伸鏈占14.52%～20.92%，β- 折疊占7.13%～10.42%，無規(guī)則卷曲占31.57%～41.59%；其二級結(jié)構(gòu)以α- 螺旋和無規(guī)則卷曲為主（表4）。

表4 GhLOX 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析 %

2.5 GhLOX 家族基因在不同組織及在冷、熱、鹽、PEG脅迫下的表達(dá)模式分析

由圖5 可知，9-GhLOX亞家族的7個成員中，GhLOX-A9、GhLOX-D9.2、GhLOX-A13、GhLOXD13在各組織均有表達(dá)；13-GhLOX I亞家族的9 個成員在各組織中多為不表達(dá)或低表達(dá)；而13-GhLOXII亞家族的6 個基因在各組織中均有表達(dá)，特別是GhLOX-A5、GhLOX-D5在花托中高表達(dá)，可能預(yù)示著這2 個基因是花托發(fā)育中的關(guān)鍵基因。綜上可知，具有組織特異性基因多為9-GhLOX和13-GhLOX II亞家族成員。

9-GhLOX亞家族中的GhLOX-A9、GhLOXD9.2、GhLOX-A13、GhLOX-D13在4 種脅迫下均有表達(dá)。而13-GhLOX I中9 個基因均表現(xiàn)出低表達(dá)或不表達(dá)；13-GhLOX II亞家族的6 個基因在4 種脅迫中均表達(dá)，值得注意的是，GhLOX-A5和GhLOX-D5表現(xiàn)出了極高的表達(dá)量。由此推測13-GhLOX II亞家族在應(yīng)對非生物脅迫時起到關(guān)鍵作用，保證了植物體的正常生命活動。

2.6 GhLOX 基因在4 ℃冷脅迫下的表達(dá)模式分析

冷脅迫下的差異表達(dá)分析結(jié)果顯示（圖6），9-GhLOX家族基因中的GhLOX-D9.2和GhLOXD13在0～12 h 的表達(dá)受到抑制，之后表達(dá)恢復(fù)；13-GhLOXⅠ家族基因中的GhLOX-A8.1和GhLOX-D8.1均高于0 h 的表達(dá)量，其中，GhLOXA8.1在12 h 表達(dá)量最高，而GhLOX-D8.1在1 h 的表達(dá)量最高，且彼此之間的差異顯著（P＜0.05）；13-GhLOXII家族基因中的GhLOX-D5和GhLOXD10的表達(dá)量均顯著高于0 h（P＜0.05），整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中，GhLOX-D5在6 h 表達(dá)量最高，約為0 h 的15.5 倍，GhLOX-D10在24 h表達(dá)量最高，比0 h 上調(diào)約8 倍。

3 結(jié)論與討論

本研究鑒定的22 個GhLOX家族基因，在陸地棉的A 亞組和D 亞組上各分布11 個GhLOX基因，在細(xì)胞質(zhì)與葉綠體中行使其功能；均含有5 個組氨酸殘基相連的保守基序，二級結(jié)構(gòu)以α- 螺旋和無規(guī)則卷曲為主。依催化底物生成的中間產(chǎn)物不同，被分為9-GhLOX、13-GhLOX I、13-GhLOX II共3 個亞家族，其中，13-GhLOX II亞家族的基因結(jié)構(gòu)差異最大。值得注意的是，13-GhLOX I家族GhLOX-A13、GhLOX-D13在進(jìn)化樹中與AtLOX1聚類結(jié)果表明，這2 個基因也可能在根發(fā)育、葉衰老、病原菌感染和茉莉酸甲酯含量高時被激活[18]。13-GhLOX II家族的GhLOX-A5、GhLOX-D5在進(jìn)化樹中與AtLOX2的聚類結(jié)果表明，這2 個基因可能通過合成茉莉酸來引起相關(guān)抗逆反應(yīng)，以保證植物的正常生長[19]。

本研究差異表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，GhLOX存在組織表達(dá)特異性和非生物脅迫響應(yīng)基因，尤其是13-GhLOX II家族基因中的GhLOX-D5和GhLOXD10在花托中超高表達(dá)，且積極參與非生物脅迫的應(yīng)答，這與擬南芥中的AtLOX能夠?qū)Σ涣辑h(huán)境等非生物脅迫下做出應(yīng)激反應(yīng)相一致[20]。進(jìn)一步對低溫處理不同時間的GhLOX家族基因的表達(dá)模式研究發(fā)現(xiàn)，9-GhLOX亞家族的GhLOX-D9.2、GhLOX-D13在受到短時間（＜12 h）冷脅迫時表達(dá)量下降，脅迫時間高于12 h 的表達(dá)量可恢復(fù)到0 h 水平，推測這2 個基因存在一個逐步適應(yīng)的過程；13-GhLOX I亞家族在脅迫開始后表達(dá)量上升，之后開始下降，反應(yīng)較為迅速；13-GhLOX II亞家族在抵抗冷脅迫時反應(yīng)更為迅速，且表達(dá)量更高。盡管本研究表明，6 個GhLOX基因都在冷脅迫中呈現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，但應(yīng)答的速度、表達(dá)量上調(diào)的幅度和持續(xù)的時間都存在差異，這還有待進(jìn)一步研究。

本研究共鑒定了22 個GhLOX家族基因，A 基因組和D 基因組各分布著11 個基因，多為酸性親水性蛋白，定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，均含有“H-X4-H-X5-H- X17-H-X8-H”38 個殘基的保守序列。進(jìn)化關(guān)系顯示，與蘿卜的親緣關(guān)系更近。差異表達(dá)分析顯示，GhLOX-A5和GhLOX-D5在花托中具有組織表達(dá)特異性，且在4 種脅迫下均表現(xiàn)為超高表達(dá)，特別是GhLOX-D5在4 ℃低溫處理6 h 的表達(dá)量最高，約為0 h 表達(dá)量的15.5 倍，說明GhLOX-D5高度參與陸地棉冷脅迫的響應(yīng)，為棉花在逆境下的育種提供了一定的理論基礎(chǔ)。而GhLOX基因家族的功能和在脅迫下的響應(yīng)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。