HPLC法測定藏藥三果湯中沒食子酸、三沒食子酰基葡萄糖和五沒食子?；咸烟堑暮?/h1>
2021-05-21 08:30黃寬林艾和張艷嬌范源
中國民族民間醫(yī)藥·下半月 2021年2期
黃寬 林艾和 張艷嬌 范源
【摘 要】 目的：建立同時測定藏藥三果湯中3種成分含量的HPLC法。方法：采用高效液相色譜法測定余甘子中沒食子酸（Gallica acid，GA）、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟牵?，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）和1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖（1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose，PGG）的含量。色譜柱為Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫，流速為0.8mL/min，檢測波長為260nm，柱溫為25℃，進樣量為10μL。結(jié)果：GA、TGG和PGG分別在0.3910～3.9100mg/mL（r=1，n=6），0.1300～1.300mg/mL（r=0.9998，n=6），0.0710～0.7100mg/mL（r=0.9999，n=6）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率均符合含量測定要求。結(jié)論：該方法簡便、準確，可以用于藏藥三果湯中GA、TGG和PGG成分的含量測定?？蔀槿麥邢嚓P(guān)成分的質(zhì)控提供一定理論參考。
【關(guān)鍵詞】 HPLC;藏藥三果湯;沒食子酸;1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖;1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖
【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）04-0036-04
Abstract：Objective A HPLC method for simultaneous determination of three components in Tibetan medicine Triphala decoction was established.Methods The contents of Gallica acid（GA）， 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose（TGG） and 1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose（PGG） in Phyllanthus emblica were determined by HPLC. The chromatographic column was Agilent Zorbax C18 bonded silica gel column （150mm×4.6mm，5μm）， mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid gradient elution， the flow rate was 0.8mL/min， the detection wavelength was 260nm， the column temperature was 25℃， and the injection volume was 10μL.Results GA，TGG and PGG showed a good linear relationship in the range of 0.3910～3.9100mg/mL，0.1300～1.300mg/mL and 0.0710～0.7100mg/mL， respectively. The recoveries of added samples all met the requirements of content determination.Conciusion The method is simple， accurate and can be used for the determination of GA， TGG and PGG in Tibetan medicine Triphala decoction. It can provide some theoretical reference for the quality control of related components in Triphala decoction.
Keywords：HPLC; Tibetan Medicine TriphalaDecoction; Pyrogallic acid; 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose; 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose
藏藥三果湯又名哲布湯，由余甘子、訶子、毛訶子組成，是藏藥中重要的常見基礎(chǔ)方，具有調(diào)節(jié)“隆”和“血”的功效。三果湯始載于《四部醫(yī)典》，具有治療瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型的作用[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認為三果湯方中余甘子味甘、酸、澀，歸肺、胃經(jīng)，性涼;訶子味苦、酸、澀，歸肺、大腸經(jīng)，性平;毛訶子味甘、澀，性平。三味藥合用具有清熱、調(diào)和氣血的功效。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三果湯具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、降糖[9]、降脂[10]等藥理作用。三果湯主要含有鞣質(zhì)酚酸類成分[11]，沒食子酸是鞣質(zhì)的重要組成成分，其常見的衍生物為1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖和1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖，研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸及其酯類衍生物都具有抗癌藥理活性[12-13]。目前研究單味藥的化學(xué)成分含量及藥理活性較為常見，而對三果湯復(fù)方研究較少。本研究針對三果湯中沒食子酸及其衍生物1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖進行含量測定，為提高藏藥三果湯質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。
1 儀器與試劑
Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm）;DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機（永康式速鋒工貿(mào)有限公司）;T-1000型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）。
沒食子酸（Gallica acid，GA）購自四川省維克奇生物科技有限公司（批號：wkq16081904）、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟牵?，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）購自武漢天植生物技術(shù)有限公司（批號：CFS201802）、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟牵?，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose，PGG）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號：PRF10011001）;乙腈（色譜純），磷酸（分析純）購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm）;電子天平（購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液;梯度洗脫：0～6min，4%～8%;6～30min，8%～20%;30～55min，20%～40%;檢測波長260nm;柱溫：25℃;流速：0.8mL/min;進樣量為10μL。色譜圖如圖1所示。
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取GA、3GG、PGG對照品3.9mg、1.3mg、0.7mg，置于10mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39mg/mL、0.13mg/mL、0.07mg/mL的混合對照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜進行過濾處理，備用。
2.2.2 供試品溶液 取訶子、毛訶子、余甘子藥材（去核）各5.0g，搗碎，加入100mL餾水，浸泡30min，煎煮3次，每次20min，過濾，合并3次濾液，濃縮10mL的三果湯水提物，吸取水提物1mL，加50%甲醇定容50mL容量瓶中，冷藏備用。用0.45μm的微孔濾膜進行過濾處理，即得到樣品溶液。
2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1”項條件下依次連續(xù)進樣，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），峰面積（mAU*s）為縱坐標（Y）進行線性回歸，繪制標準曲線，結(jié)果見表1，表明各成分均具有良好的線性關(guān)系。
2.4 精密度 試驗精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG峰面積RSD分別為1.22%、1.58%、1.01%，表明儀器精密度良好。
2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12h進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG 10 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.77%、1.39%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.6 重復(fù)性試驗 取同一批三果湯粉末6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG含有量RSD分別為1.18%、0.37%、0.83%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批三果湯粉末6份，每份精密稱取5.0g，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，加入GA、TGG、PGG對照品適量（約相當于5.0 g樣品中所含GA、3GG和PGG的量），再按“2.3”項下色譜條件，進樣10μL，進行檢測，計算平均回收率。按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，在“2.1”項條件下進樣。結(jié)果見表2。
2.8 含量測定 取3份不同批次余甘子樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，計算四種成分含有量。結(jié)果見表3。
3 討論
三果湯作為傳統(tǒng)藏藥在臨床上應(yīng)用廣泛，且具有良好的臨床療效。鞣質(zhì)酚酸類化合物是三果湯的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式處理樣品。對比煎煮次數(shù)，結(jié)果顯示，煎煮三次時，含量達到最高。
預(yù)實驗分別以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動相進行考察，當乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，采用梯度洗脫，目標峰的色譜圖峰拖尾得到改善，且峰形更好，達到更高的分離度，因此選定乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，還對柱溫（25、30、35、40℃）和流速（0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL/min）進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，柱溫25℃、流速0.8mL/min 時分離效果較佳。
本研究建立同時測定藏藥三果湯中沒食子酸、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖含量的高效液相色譜法，供試品制備簡便，結(jié)果準確，重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可為三果湯質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。
參考文獻
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[3]SIREERATAWONG S， JAIJOY K， Soonthornchareonnon N， et al. Evaluation of anti-inflammatory and antinociceptive activity of Triphala recipe[J]. African Journal of Traditional， Complementary and Alternative Medicines， 2013， 10（2）： 246-250.
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[8]李軒豪，劉蘭茹，龍偉， 等.基于計算藥理學(xué)的藏藥三果湯散抗氧化研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（9）：4139-4142.
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（收稿日期：2020-08-25 編輯：劉斌）
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黃寬 林艾和 張艷嬌 范源
【摘 要】 目的：建立同時測定藏藥三果湯中3種成分含量的HPLC法。方法：采用高效液相色譜法測定余甘子中沒食子酸（Gallica acid，GA）、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟牵?，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）和1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖（1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose，PGG）的含量。色譜柱為Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫，流速為0.8mL/min，檢測波長為260nm，柱溫為25℃，進樣量為10μL。結(jié)果：GA、TGG和PGG分別在0.3910～3.9100mg/mL（r=1，n=6），0.1300～1.300mg/mL（r=0.9998，n=6），0.0710～0.7100mg/mL（r=0.9999，n=6）范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，加樣回收率均符合含量測定要求。結(jié)論：該方法簡便、準確，可以用于藏藥三果湯中GA、TGG和PGG成分的含量測定?？蔀槿麥邢嚓P(guān)成分的質(zhì)控提供一定理論參考。
【關(guān)鍵詞】 HPLC;藏藥三果湯;沒食子酸;1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖;1，2，3，4，6-O-五沒食子酰葡萄糖
【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）04-0036-04
Abstract：Objective A HPLC method for simultaneous determination of three components in Tibetan medicine Triphala decoction was established.Methods The contents of Gallica acid（GA）， 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose（TGG） and 1，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose（PGG） in Phyllanthus emblica were determined by HPLC. The chromatographic column was Agilent Zorbax C18 bonded silica gel column （150mm×4.6mm，5μm）， mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid gradient elution， the flow rate was 0.8mL/min， the detection wavelength was 260nm， the column temperature was 25℃， and the injection volume was 10μL.Results GA，TGG and PGG showed a good linear relationship in the range of 0.3910～3.9100mg/mL，0.1300～1.300mg/mL and 0.0710～0.7100mg/mL， respectively. The recoveries of added samples all met the requirements of content determination.Conciusion The method is simple， accurate and can be used for the determination of GA， TGG and PGG in Tibetan medicine Triphala decoction. It can provide some theoretical reference for the quality control of related components in Triphala decoction.
Keywords：HPLC; Tibetan Medicine TriphalaDecoction; Pyrogallic acid; 1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose; 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose
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現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三果湯具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、降糖[9]、降脂[10]等藥理作用。三果湯主要含有鞣質(zhì)酚酸類成分[11]，沒食子酸是鞣質(zhì)的重要組成成分，其常見的衍生物為1，3，6-O-三沒食子酰基葡萄糖和1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖，研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸及其酯類衍生物都具有抗癌藥理活性[12-13]。目前研究單味藥的化學(xué)成分含量及藥理活性較為常見，而對三果湯復(fù)方研究較少。本研究針對三果湯中沒食子酸及其衍生物1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖進行含量測定，為提高藏藥三果湯質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。
1 儀器與試劑
Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm）;DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機（永康式速鋒工貿(mào)有限公司）;T-1000型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）。
沒食子酸（Gallica acid，GA）購自四川省維克奇生物科技有限公司（批號：wkq16081904）、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟牵?，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG）購自武漢天植生物技術(shù)有限公司（批號：CFS201802）、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟牵?，2，3，4，6-O-galloyl-D-glucose，PGG）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號：PRF10011001）;乙腈（色譜純），磷酸（分析純）購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司;Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱（150mm×4.6mm，5μm）;電子天平（購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱（4.6mm×150mm，5μm）;流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液;梯度洗脫：0～6min，4%～8%;6～30min，8%～20%;30～55min，20%～40%;檢測波長260nm;柱溫：25℃;流速：0.8mL/min;進樣量為10μL。色譜圖如圖1所示。
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取GA、3GG、PGG對照品3.9mg、1.3mg、0.7mg，置于10mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39mg/mL、0.13mg/mL、0.07mg/mL的混合對照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜進行過濾處理，備用。
2.2.2 供試品溶液 取訶子、毛訶子、余甘子藥材（去核）各5.0g，搗碎，加入100mL餾水，浸泡30min，煎煮3次，每次20min，過濾，合并3次濾液，濃縮10mL的三果湯水提物，吸取水提物1mL，加50%甲醇定容50mL容量瓶中，冷藏備用。用0.45μm的微孔濾膜進行過濾處理，即得到樣品溶液。
2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1”項條件下依次連續(xù)進樣，以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），峰面積（mAU*s）為縱坐標（Y）進行線性回歸，繪制標準曲線，結(jié)果見表1，表明各成分均具有良好的線性關(guān)系。
2.4 精密度 試驗精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG峰面積RSD分別為1.22%、1.58%、1.01%，表明儀器精密度良好。
2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12h進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG 10 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.77%、1.39%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.6 重復(fù)性試驗 取同一批三果湯粉末6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG含有量RSD分別為1.18%、0.37%、0.83%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批三果湯粉末6份，每份精密稱取5.0g，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，加入GA、TGG、PGG對照品適量（約相當于5.0 g樣品中所含GA、3GG和PGG的量），再按“2.3”項下色譜條件，進樣10μL，進行檢測，計算平均回收率。按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，在“2.1”項條件下進樣。結(jié)果見表2。
2.8 含量測定 取3份不同批次余甘子樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，計算四種成分含有量。結(jié)果見表3。
3 討論
三果湯作為傳統(tǒng)藏藥在臨床上應(yīng)用廣泛，且具有良好的臨床療效。鞣質(zhì)酚酸類化合物是三果湯的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式處理樣品。對比煎煮次數(shù)，結(jié)果顯示，煎煮三次時，含量達到最高。
預(yù)實驗分別以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動相進行考察，當乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，采用梯度洗脫，目標峰的色譜圖峰拖尾得到改善，且峰形更好，達到更高的分離度，因此選定乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，還對柱溫（25、30、35、40℃）和流速（0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL/min）進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，柱溫25℃、流速0.8mL/min 時分離效果較佳。
本研究建立同時測定藏藥三果湯中沒食子酸、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?、1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖含量的高效液相色譜法，供試品制備簡便，結(jié)果準確，重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可為三果湯質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。
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（收稿日期：2020-08-25 編輯：劉斌）
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