張濤,鄧思,陳艷紅,2,3,4*,杜希萍,2,3,4

1(集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門,361021)2(福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門,361021)3(廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心,福建 廈門,361021)4(廈門南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門,361021)

法夫酵母因是天然蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素)的重要來源而受到廣泛關(guān)注[5-9]。研究報(bào)道蝦青素具有抗氧化[10]、抗炎[11]、抗癌[12]以及預(yù)防心血管疾病等多種生理活性[13]。法夫酵母具有類胡蘿卜素合成的復(fù)雜途徑[14-16]。在之前的研究中,從法夫酵母提取物中鑒定出蝦青素、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃素和番茄紅素等多種類胡蘿卜素[17]。這些類胡蘿卜素由于結(jié)構(gòu)相似很難分離。目前,它們生理活性之間的相互作用還不清楚。本文采用DPPH自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、·OH清除率、鐵離子還原能力、抗油脂過氧化能力和ORAC法評(píng)價(jià)蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化能力,并以DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、·OH清除率為指標(biāo)研究蝦青素和β-胡蘿卜素以不同濃度組合的抗氧化效果,為利用法夫酵母開發(fā)高效的抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦青素(100%,USP級(jí))、β-胡蘿卜素(≥95%,(HPLC級(jí)),美國(guó)Sigma-Aldrich公司；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、水楊酸、過硫化鉀、K2HPO4、FeSO4·7H2O、FeCl3, 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;熒光素鈉、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、水溶性維生素E(Trolox),均為分析純，北京索萊寶科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mettler Toledo電子天平,順迪嘉奧有限公司；BMG全波長(zhǎng)自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀微孔板檢測(cè)儀,廣州伯齊生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

用甲醇將8.00 mg DPPH配成濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液,用甲醇制備質(zhì)量濃度為2、4、8、16、32、64 μg/mL的蝦青素或β-胡蘿卜素的待測(cè)液。在96孔酶標(biāo)板中依次加入50 μL DPPH自由基溶液和50 μL待測(cè)液,30 ℃反應(yīng)30 min,于517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。維生素E(VE)作為陽(yáng)性對(duì)照,3次平行實(shí)驗(yàn),清除率由公式(1)計(jì)算[18]：

(1)

式中：A0,待測(cè)液用甲醇替代,加入DPPH自由基的吸光度；AX,添加待測(cè)液和DPPH自由基的吸光度；A1,加入待測(cè)液,DPPH自由基用甲醇替代的吸光度。

1.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

用蒸餾水分別配制7 mmol/L的ABTS陽(yáng)離子自由基溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8溶液,均勻混合,常溫避光15 h,之后將混合液用甲醇制成734 nm波長(zhǎng)下吸光度為(0.70±0.02)的工作液。將10 μL 1.3.1所述待測(cè)液和200 μL ABTS陽(yáng)離子自由基工作液依次加入96孔酶標(biāo)板中,30 ℃反應(yīng)6 min,測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處吸光度。以VE作為陽(yáng)性對(duì)照,3次平行實(shí)驗(yàn),清除率由公式(2)計(jì)算[19]：

(2)

式中：A0,待測(cè)液用甲醇替代,加入ABTS陽(yáng)離子自由基的吸光度；AX,添加待測(cè)液和ABTS陽(yáng)離子自由基的吸光度。

1.3.3 ·OH清除率的測(cè)定

將50 μL 2.25 mmol/L FeSO4水溶液、50 μL 9 mmol/L水楊酸甲醇溶液、50 μL 1.3.1所述待測(cè)液依次加入96孔酶標(biāo)板中,再加入50 μL 8.80 mmol/L H2O2甲醇溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),37 ℃反應(yīng)30 min,測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處吸光度A。以VE作為陽(yáng)性對(duì)照,3次平行實(shí)驗(yàn),清除率由公式(3)計(jì)算[20]：

(3)

式中：Ax,添加待測(cè)液時(shí)的吸光度；A0,待測(cè)液用甲醇替代時(shí)的吸光度；A1,水楊酸甲醇溶液和H2O2甲醇溶液均用甲醇替代時(shí)的吸光度。

1.3.4 鐵離子還原能力測(cè)定

參考BENZIE等[21]的方法并略加修改。以pH 3.6醋酸鈉緩沖溶液∶20 mmol/L FeCl3水溶液∶10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪鹽酸溶液(10∶1∶1,體積比)混合制成鐵離子還原/抗氧化能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)工作液。在96孔酶標(biāo)板中依次加入5 μL不同濃度的FeSO4溶液(50、100、200、400、800、1 600 μmol/L)、150 μL FRAP工作液和15 μL 蒸餾水,混勻,37 ℃避光,每隔10 min測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光度。橫坐標(biāo)為FeSO4溶液濃度,縱坐標(biāo)為吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.269 2x+0.014 1,R2=0.999 4。測(cè)定鐵離子還原能力：將5 μL 64 μg/mL待測(cè)液、150 μL FRAP工作液和15 μL 蒸餾水依次加入96孔酶標(biāo)板中,混勻,37 ℃避光,每隔10 min測(cè)定595 nm波長(zhǎng)處吸光度。陽(yáng)性對(duì)照為VE,3次平行實(shí)驗(yàn),以達(dá)到相同吸光度所需FeSO4濃度表示待測(cè)液的鐵離子還原能力。

1.3.5 抗油脂過氧化能力測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分成4組,空白組(35 mL橄欖油)、蝦青素組(0.007 5 g蝦青素+35 mL橄欖油)、β-胡蘿卜素組(0.007 5 g β-胡蘿卜素+35 mL橄欖油)和VE組(0.007 5 g VE+35 mL橄欖油)。所有實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,密封,60 ℃放置,每天根據(jù)GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測(cè)定》中滴定法測(cè)定過氧化值。過氧化值以每千克中活性氧的毫克當(dāng)量(meq/kg)表示。

1.3.6 氧自由基吸收能力(oxygen-radical absorbance capacity,ORAC)法評(píng)價(jià)抗氧化能力

按照徐維盛等[22]報(bào)道ORAC法評(píng)價(jià)抗氧化能力。熒光素鈉、自由基產(chǎn)生劑2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide,dihydrochlori,AAPH)、抗氧化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox均用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋到適當(dāng)濃度。設(shè)置空白孔、對(duì)照孔、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液孔(Trolox)和樣品孔。在96孔黑色酶標(biāo)板中依次加入25 μL待測(cè)樣、150 μL 86.1 nmol /L熒光素鈉溶液,37 ℃溫育10 min,迅速加入25 μL 153 mmol/L AAPH溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)538 nm連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度,每隔2 min 測(cè)定1次熒光值,每次測(cè)定前中速振動(dòng)孔板10 s。熒光衰減呈基線后停止測(cè)定,將每次測(cè)定的值與初始熒光強(qiáng)度的比值記為fn。根據(jù)公式(4)計(jì)算各孔熒光強(qiáng)度曲線下的面積(area under the curve,AUC),減掉空白孔的AUC,即得到各孔的Net AUC,根據(jù)不同濃度Trolox的Net AUC做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各樣品的ORAC值,待測(cè)樣品的ORAC值以μmol TE/g表示,具體按公式(5)計(jì)算：

AUC=2×(f0+f1+f2+…fn-1+fn)-f0-fn

(4)

(5)

1.4 協(xié)同抗氧化活性的測(cè)定

1.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

以2、4、8、16 μg/mL 4個(gè)劑量對(duì)蝦青素和β-胡蘿卜素進(jìn)行兩兩組合,方法同1.3.1。

1.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定

以2、4、8、16 μg/mL 4個(gè)劑量對(duì)蝦青素和β-胡蘿卜素進(jìn)行兩兩組合,方法同1.3.2。

1.4.3 ·OH清除率的測(cè)定

以2、4、8、16 μg/mL 4個(gè)劑量對(duì)蝦青素和β-胡蘿卜素進(jìn)行兩兩組合,方法同1.3.3。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除率及協(xié)同作用

由圖1可知,質(zhì)量濃度2～64 μg/mL時(shí),蝦青素、β-胡蘿卜素和VE均具有DPPH自由基清除能力,并且呈劑量依賴性。16～64 μg/mL時(shí),蝦青素對(duì)DPPH自由基清除能力顯著強(qiáng)于β-胡蘿卜素和VE(P<0.05)；當(dāng)蝦青素為64 μg/mL時(shí),蝦青素對(duì)DPPH自由基的清除率為(71.61±3.01)%。蝦青素對(duì)DPPH自由基的半最大效應(yīng)濃度(EC50)值為(29.95±3.01)μg/mL,而在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未計(jì)算出β-胡蘿卜素和VE的EC50值。

圖1 不同質(zhì)量濃度蝦青素、β-胡蘿卜素和VE對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH scavenging ability of different concentration of astaxanthin,β-carotene and VE

由表1可知,不同質(zhì)量濃度的β-胡蘿卜素與蝦青素(16 μg/mL除外)組合對(duì)DPPH自由基清除率有協(xié)同作用,8 μg/mL蝦青素與8 μg/mL β-胡蘿卜素組合協(xié)同作用最強(qiáng),協(xié)同作用值為16.78%。但16 μg/mL的蝦青素與任意濃度的β-胡蘿卜素組合均表現(xiàn)為拮抗。

表1 不同質(zhì)量濃度蝦青素和β-胡蘿卜素組合的DPPH自由基清除能力的值及相互作用關(guān)系Table 1 DPPH radical scavenging capacity value and interaction effect of astaxanthin and β-carotene at different concentration

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度較高(8或16 μg/mL)時(shí),增大蝦青素的質(zhì)量濃度(2～8 μg/mL)有促進(jìn)協(xié)同作用的趨勢(shì)；當(dāng)β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度較低(2或4 μg/mL)時(shí),協(xié)同作用隨蝦青素濃度的增加(2～8 μg/mL)呈先上升后下降的趨勢(shì)。結(jié)果表明,DPPH自由基抗氧化組合中,高質(zhì)量濃度蝦青素(16 μg/mL)與β-胡蘿卜素組合不利于兩者產(chǎn)生協(xié)同抗氧化作用。

2.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率及協(xié)同作用

由圖2可知,蝦青素、β-胡蘿卜素和VE在試驗(yàn)濃度范圍(2～64 μg/mL)內(nèi),除β-胡蘿卜素在16 μg/mL時(shí)對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率略有下降,其余對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率均呈現(xiàn)出劑量依賴性。蝦青素的EC50值為(61.21±4.17)μg/mL,而β-胡蘿卜素和VE在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未計(jì)算出EC50值。此外,在8～64 μg/mL的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),蝦青素清除ABTS陽(yáng)離子自由基能力強(qiáng)于β-胡蘿卜素和VE,當(dāng)質(zhì)量濃度為64 μg/mL時(shí),蝦青素對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率最高,為(51.17±1.17)%。

圖2 蝦青素、β-胡蘿卜素、VE的ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力Fig.2 ABTS cationic radical scavenging ability of astaxanthin,β-carotene and VE

由表2可知,除16 μg/mL蝦青素與2 μg/mL β-胡蘿卜素的組合外,蝦青素與任意濃度的β-胡蘿卜素組合均對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率有協(xié)同作用；協(xié)同作用最強(qiáng)為8 μg/mL蝦青素與8 μg/mL β-胡蘿卜素組合,協(xié)同作用值為63.64%；而16 μg/mL蝦青素與2 μg/mL β-胡蘿卜素的拮抗作用值為11.39%。總體來看,當(dāng)β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度為2 μg/mL時(shí),增大蝦青素的濃度有促進(jìn)拮抗作用的趨勢(shì)；當(dāng)蝦青素質(zhì)量濃度為16 μg/mL時(shí),協(xié)同作用隨β-胡蘿卜素濃度的增加而增強(qiáng)。結(jié)果表明,ABTS陽(yáng)離子自由基抗氧化組合中,高質(zhì)量濃度的蝦青素(16 μg/mL)與低質(zhì)量濃度的β-胡蘿卜素(2 μg/mL)組合不利于兩者產(chǎn)生抗氧化協(xié)同作用。

表2 不同濃度蝦青素和β-胡蘿卜素組合的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的值及相互作用關(guān)系Table 2 ABTS cationic radical scavenging capacity value and interaction effect of astaxanthin and β-carotene at different concentrations

2.3 ·OH清除率及協(xié)同作用

由圖3可知,在2～64 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),蝦青素、β-胡蘿卜素和VE具有·OH清除活性。蝦青素的·OH清除率顯著高于β-胡蘿卜素和VE,當(dāng)蝦青素質(zhì)量濃度為64 μg/mL時(shí),其對(duì)·OH的清除率最高,為(69.82±1.72)%。蝦青素的EC50值為(26.12±5.14)μg/mL,VE和β-胡蘿卜素在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均未計(jì)算出EC50值。蝦青素和VE的·OH清除率隨濃度的增加均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系,β-胡蘿卜素的·OH清除率在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)變化不大,且呈現(xiàn)出波動(dòng)趨勢(shì),無明顯的量效關(guān)系。

圖3 蝦青素、β-胡蘿卜素、VE的·OH清除率Fig.3 ·OH free radical scavenging ability of astaxanthin,β-carotene and VE

由表3可知,樣品在2～16 μg/mL,蝦青素與β-胡蘿卜素組合的·OH抗氧化活性相互作用情況復(fù)雜。低質(zhì)量濃度β-胡蘿卜素(2或4 μg/mL)與不同濃度蝦青素的組合對(duì)·OH清除能力有協(xié)同作用,16 μg/mL蝦青素與2 μg/mL β-胡蘿卜素的協(xié)同作用最大,為9.03%。但是,高質(zhì)量濃度β-胡蘿卜素(8或16 μg/mL)與不同質(zhì)量濃度蝦青素(2 μg/mL蝦青素除外)的組合有拮抗作用,最強(qiáng)為16 μg/mL β-胡蘿卜素與8 μg/mL蝦青素組合,拮抗作用值為9.33%?！H抗氧化組合中,較高質(zhì)量濃度的蝦青素(4～16 μg/mL)與較高質(zhì)量濃度的β-胡蘿卜素(8或16 μg/mL)結(jié)合不利于兩者產(chǎn)生協(xié)同抗氧化作用。

表3 不同濃度蝦青素和β-胡蘿卜素組合的·OH清除能力的值及相互作用關(guān)系Table 3 ·OH radical scavenging capacity value and interaction effect of astaxanthin and β-carotene at different concentrations

2.4 鐵離子還原能力

由圖4可知,β-胡蘿卜素、蝦青素和VE均具有鐵離子還原能力。當(dāng)質(zhì)量濃度為64 μg/mL時(shí),β-胡蘿卜素、蝦青素和VE的FRAP值分別為(0.1200±0.011)、(0.2816±0.005)和(0.1020±0.0012)mmol/L?？梢?蝦青素的鐵離子還原能力強(qiáng)于β-胡蘿卜素和陽(yáng)性對(duì)照VE,VE的鐵離子還原能力最弱。

圖4 β-胡蘿卜素、蝦青素和VE的鐵離子還原能力Fig.4 Iron ion reduction ability of β-carotene,astaxanthin and VE

2.5 抗油脂過氧化作用

由圖5可知,所有組橄欖油的過氧化值均隨著放置時(shí)間的增加而逐漸增大,添加蝦青素、β-胡蘿卜素和VE后橄欖油的過氧化值減小,說明它們具有一定的抗油脂過氧化作用。5 d后,蝦青素、β-胡蘿卜素和VE處理組的過氧化值分別為(3.50±0.10)、(7.60±0.11)和(5.34±0.02)meq/kg?？梢?蝦青素抗油脂的過氧化能力最強(qiáng),β-胡蘿卜素抗油脂的過氧化能力最弱。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,VE具有長(zhǎng)鏈飽和烴基結(jié)構(gòu),而蝦青素比VE具有更多的可置換結(jié)構(gòu)和不飽和雙鍵[23],這種可置換結(jié)構(gòu)可能導(dǎo)致蝦青素具有比VE更強(qiáng)的抗油脂過氧化作用[24]。

圖5 蝦青素、β-胡蘿卜素、VE的抗油脂過氧化作用Fig.5 Antiperoxide effects of astaxanthin,β-carotene and VE

2.6 ORAC法評(píng)價(jià)抗氧化能力

由圖6可知,無抗氧化劑Trolox時(shí),熒光衰退很明顯；添加Trolox會(huì)抑制熒光衰退速度,并且抑制作用隨Trolox濃度增大而逐漸增強(qiáng)。根據(jù)橫坐標(biāo)是Trolox濃度,縱坐標(biāo)是凈面積,得到Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.015 5x+0.095 6,R2=0.996。

圖6 不同濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液熒光隨時(shí)間衰減曲線Fig.6 Time course of the reaction of fluoresce with AAPH in the presence of Trolox standard solution無自由基的熒光素鈉溶液熒光自然衰減對(duì)照；AAPH+：不含抗氧化劑的自由基對(duì)照；Trolox1～Trolox4：加入6.25、12.5、25.0、50.0 μmol/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)熒光強(qiáng)度衰減的影響

圖7為蝦青素、β-胡蘿卜素?zé)晒怆S時(shí)間衰減曲線，根據(jù)衰減曲線計(jì)算出凈面積。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蝦青素的ORAC值為(4 325±11.79)μmol TE/g,β-胡蘿卜素的ORAC值為(2 029±10.01)μmol TE/g,蝦青素的ORAC值顯著高于β-胡蘿卜素的ORAC值,說明蝦青素具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

圖7 蝦青素、β-胡蘿卜素?zé)晒怆S時(shí)間衰減曲線Fig.7 Time course of the reaction of fluoresce with AAPH in the presence of astaxanthin and β-carotene

3 討論

抗氧化體外評(píng)價(jià)方法因具有快速便捷的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。本文選擇了6種抗氧化方法全面評(píng)價(jià)蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化活性。結(jié)果表明,在6種抗氧化實(shí)驗(yàn)中,蝦青素和β-胡蘿卜素均具有抗氧化活性。其中蝦青素對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和·OH清除率最強(qiáng),其EC50值分別為(29.95±3.01)、(61.21±4.17)和(26.12±5.14)μg/mL；當(dāng)AAPH-：質(zhì)量濃度為64 μg/mL時(shí),蝦青素和β-胡蘿卜素的FRAP值分別為(0.281 6±0.005)和(0.120 0±0.011)mmol/L；5 d后,蝦青素和β-胡蘿卜素的過氧化值分別為(3.50±0.10)和(7.60±0.11)meq/kg；在相同濃度下蝦青素和β-胡蘿卜素的ORAC值分別為(4 325±11.79)和(2 029±10.01)μmol TE/g。綜上,蝦青素的抗氧化能力優(yōu)于β-胡蘿卜素,此結(jié)果與LIU等[25]研究結(jié)果一致。蝦青素具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì),蝦青素骨架中的共軛雙鍵及末端的不飽和酮基和羥基相互作用,加劇分子之間的摩擦力度,可以促進(jìn)電子的自由移動(dòng),自由基負(fù)責(zé)提供電子與未配對(duì)電子相互吸引,能有效地淬滅附近的自由基及有害的活性氧[26]。據(jù)報(bào)道,蝦青素除了不飽和多烯鏈在膜中捕獲自由基外,其極性末端環(huán)部分能夠通過分子間和分子內(nèi)氫鍵捕獲膜內(nèi)和膜表面的自由基,從而在幾種抗氧化體系中表現(xiàn)出比β-胡蘿卜素更強(qiáng)的抗氧化能力[27-29]。

抗氧化劑組合的抗氧化能力大于相同劑量的單一抗氧化劑時(shí),則抗氧化劑間存在協(xié)同作用,且抗氧化劑濃度和反應(yīng)體系等會(huì)影響協(xié)同作用效果。低效的抗氧化劑黃芩苷與β-胡蘿卜素組合后在由自由基引發(fā)的脂質(zhì)氧化反應(yīng)中表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用[30]。黃芩苷的共軛基團(tuán)有助于黃芩苷-β-胡蘿卜素抗脂質(zhì)過氧化協(xié)同作用的產(chǎn)生,其機(jī)制與葛根素-β-胡蘿卜素的協(xié)同作用相似[31]。本文研究發(fā)現(xiàn),蝦青素和β-胡蘿卜素組合對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和·OH清除率具有協(xié)同作用。此研究結(jié)果與LIANG等[32]報(bào)道蝦青素與類胡蘿卜素在脂相具有協(xié)同作用一致。這是由于類胡蘿卜素的空間分布,蝦青素固定在脂質(zhì)/水界面,來自引發(fā)劑2,2′-偶氮雙(2,4-二甲基戊腈)的初始自由基氧化蝦青素生成自由基陽(yáng)離子,與大豆卵磷脂氧化競(jìng)爭(zhēng),由于共振穩(wěn)定作用,蝦青素自由基陽(yáng)離子中的單電子被重新定位到類胡蘿卜素多烯鏈的中心,多烯鏈可以在細(xì)胞膜的親脂性中心從還原性更強(qiáng)的類胡蘿卜素β-胡蘿卜素中提取一個(gè)電子,從而以β-胡蘿卜素為代價(jià)再生蝦青素。蝦青素起著自由基橋的作用,將分子內(nèi)部還原性更強(qiáng)的類胡蘿卜素(β-胡蘿卜素)的電子傳遞到具有高偶極矩自由基集中的界面。研究發(fā)現(xiàn),高濃度蝦青素與β-胡蘿卜素組合不利于協(xié)同抗氧化作用的產(chǎn)生。許颯等[33]研究結(jié)果顯示,當(dāng)VC濃度較高,類胡蘿卜素濃度較低時(shí),兩者組合具有較好的協(xié)同抗氧化作用；但是當(dāng)類胡蘿卜素增加至一定濃度時(shí),兩者組合沒有表現(xiàn)出抗氧化協(xié)同作用。丁健等[34]研究表明,當(dāng)VC為10 mg/mL,類胡蘿卜素與VC質(zhì)量濃度比值≤1.5時(shí),或VE為0.384 mg/mL,類胡蘿卜素與VE質(zhì)量濃度比值≤1.5時(shí),類胡蘿卜素與VC或VE具有明顯的助氧化作用；而當(dāng)VC或VE濃度較低時(shí),VC或VE將加速類胡蘿卜素的降解。本研究結(jié)果顯示,16 μg/mL蝦青素與任意濃度β-胡蘿卜素組合對(duì)DPPH自由基清除率比未混合前2種單體清除能力之和低,表現(xiàn)為拮抗作用；高濃度的蝦青素與低濃度的β-胡蘿卜素結(jié)合對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率以及較高濃度的蝦青素與較高濃度的β-胡蘿卜素結(jié)合對(duì)·OH清除率均表現(xiàn)出拮抗作用?？寡趸瘎┲g的拮抗現(xiàn)象可能是由于抗氧化劑自由基加合物的形成或抗氧化劑再生之間的競(jìng)爭(zhēng),以及一種抗氧化劑的微環(huán)境被另一種抗氧化劑改變所造成的[35]。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)在多種抗氧化評(píng)價(jià)體系中,蝦青素的抗氧化能力均強(qiáng)于β-胡蘿卜素,并且蝦青素和β-胡蘿卜素組合對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基和·OH清除率具有協(xié)同作用。因此可應(yīng)用蝦青素和β-胡蘿卜素的抗氧化協(xié)同作用開發(fā)高效的抗氧化劑。同時(shí)可采用水溶性、成膜性、生物降解性良好的明膠和穩(wěn)定性、溶解性、增稠性良好的麥芽糊精為微膠囊壁材,采用噴霧干燥法制備蝦青素和β-胡蘿卜素微膠囊,以避免光和氧等因素作用下類胡蘿卜素的降解和異構(gòu)化。綜上,本文的研究結(jié)果為利用法夫酵母開發(fā)高效的抗氧化劑提供了理論依據(jù)。