楊成，王光學(xué)，張燕飛，管宏新，魏亮，鐘春龍，李欽傳

原發(fā)性肺癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其常見的遠處轉(zhuǎn)移部位為腦部，常見部位為大腦半球，其次為小腦和腦干[1]。目前臨床上對于肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)病原因尚無統(tǒng)一定論，認(rèn)為其與宿主的患病史、個人史、精神史、其他感染等相關(guān)[2]。近年來，肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率和診斷率呈逐年上升的趨勢，且肺癌腦轉(zhuǎn)移患者預(yù)后效果差，自然生存時間僅為1～2個月[3]。肺癌腦轉(zhuǎn)移患者常見的臨床癥狀為嘔吐、癲癇、發(fā)作性頭痛、精神及意識障礙。臨床上常將手術(shù)、化療、放療等綜合手段用于肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的治療中，可在一定程度上延長患者生存期，提高其生活質(zhì)量[4]。微小RNA(miRNA)可由腫瘤細胞主動分泌，其表達量隨著腫瘤細胞的生成、凋亡而變化，故miRNA表達量在一定程度上可代表人體內(nèi)健康或疾病的信息。miRNA是真核生物體內(nèi)具有良好穩(wěn)定性的非編碼RNA，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程，還在疾病發(fā)生、生物體發(fā)育時序、細胞分化凋亡等方面起重要作用[5]，但miR-423-5p在肺癌腦轉(zhuǎn)移中的作用機制尚未研究?，F(xiàn)探究miR-423-5p調(diào)控TGF-β/Smad信號通路對肺癌腦轉(zhuǎn)移模型大鼠的干預(yù)作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物: SPF級大鼠60只，雌雄各半，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供[動物許可證號：SYXK(豫)2020-0008)]，鼠齡3～6(4.75±1.19)個月，體質(zhì)量226～257(229.43±26.19)g，將大鼠置于室溫22～24℃，濕度40%～70%，自然光照、通風(fēng)的無病原菌干凈籠子中飼養(yǎng)，飲用的水和食物均經(jīng)消毒處理。本實驗經(jīng)醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。(2)試藥試劑：miR-423-5p慢病毒載體(滴度為1×108TU/ml)購于無錫萊弗思生物實驗器材有限公司；酶聯(lián)免疫試劑盒購于武漢純度生物科技有限公司；TGF-β1、COl-1抗體購于上海恒斐生物科技有限公司；Smad2/3、Vimentin抗體購于武漢益普生物科技有限公司。(3)儀器設(shè)備： OLYMPUS CX23光學(xué)顯微鏡、Primer 5.0軟件上海普赫光電科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法 2019年2月—2020年1月于同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心進行實驗，

1.2.1 肺癌腦轉(zhuǎn)移建模：在60只大鼠中隨機數(shù)字表法選取15只作為空白組，其余大鼠隨機分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組各15只，參照陳愉生等[6]肺癌腦轉(zhuǎn)移模型建立方法造模，除空白組外，其余3組大鼠均經(jīng)麻醉、仰臥位固定、消毒后，于胸骨左緣第二肋間旁開2 mm處進針3～5 mm，進針前調(diào)好BD針頭至滯留空氣0.05 ml左右，吸取肺癌細胞懸液0.1 ml(1×106個腫瘤細胞)，觀察到血液噴射涌出作為進入左心室的標(biāo)準(zhǔn)，并在10 s內(nèi)完成注射，注射完成后快速拔針，棉簽按壓進針點。參照文獻[7]判斷肺癌腦轉(zhuǎn)移建模結(jié)果(圖1)：模型組建模成功11例，上調(diào)組建模成功12例，下調(diào)組建模成功14例。

注：1、2、3輪次腦轉(zhuǎn)移，病灶血供隨輪次增加而增加；第4輪次腦轉(zhuǎn)移灶提示腦轉(zhuǎn)移模型建立成功

1.2.2 干預(yù)方法：建模成功后上調(diào)組、下調(diào)組大鼠分別尾部靜脈注射miR-423-5p mimics control 10 μl、 miR-423-5p mimics 10 μl，空白組、模型組大鼠尾部靜脈注射等體積生理鹽水，miR-423-5p干預(yù)14 d后觀察各組大鼠變化。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本采集：在miR-423-5p干預(yù)后取大鼠腦組織行HE染色。抽取大鼠尾部靜脈血2 ml，離心留取血清，置于-20℃冰箱待用。將大鼠胸腔打開，夾閉雙側(cè)肺門，結(jié)扎左右主支氣管，在左主支氣管近端刺入套針，使用4℃無菌肝素鹽水15 ml分3次灌入左肺，每次盥洗2遍，回收肺泡灌洗液10～15 ml，離心待用。游離結(jié)扎處大鼠雙肺，采用4%多聚甲醛固定左肺下葉組織，15% EDTA脫鈣、脫水后進行石蠟包埋，制作厚約3 μm組織切片。

1.3.2 肺組織病理觀察：取各組大鼠左肺下葉組織樣本進行HE染色處理，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理變化。

1.3.3 采用RT-PCR法檢測肺組織中miR-423-5p表達量：將Trizol 1 ml加至肺組織中并研磨為粉末后提取總RNA并檢測其純度和濃度，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄處理后，反應(yīng)條件：37℃反轉(zhuǎn)錄60 min；85℃滅活酶5 s，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)，使用Primer 5.0軟件對引物序列進行設(shè)計，miR-423-5p引物序列上游：5'-GGGTCTTGGAGTAGGTCATT-3'，下游：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3'；內(nèi)參基因GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3'。

1.3.4 血清CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1和肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠血清癌胚抗原(CEA)、鱗狀細胞癌相關(guān)抗原(SCC-Ag)、細胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)水平，肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，將樣本置于室溫、制備樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測樣本及標(biāo)準(zhǔn)品100 μl /孔，37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次，加入抗體工作液(1∶100稀釋后)100 μl/孔，37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；反應(yīng)板清洗4次，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl/孔，37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后，將終止液100 μl/孔加入反應(yīng)孔內(nèi)終止反應(yīng)，在450 nm處讀OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.5 TGF-β/Smad信號通路蛋白表達量檢測：采用Western-blot法檢測TGF-β/Smad信號通路蛋白表達量，將采集到的樣本研磨加入蛋白緩沖液，提取各組細胞蛋白并使用BCA法測定濃度，制備電泳樣品，上樣量50 μg進行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃ 孵育過夜，洗膜3次(5 min/次)，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次(5 min/次)，加入發(fā)光液曝光3～4次，取重疊值。采用軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白為Actin。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化比較 空白組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄、間隔正常，未出現(xiàn)炎性細胞浸潤、肉芽腫的形成；模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)損傷，部分肺泡萎陷或消失、間隔增厚，在肺泡腔和肺泡間質(zhì)中出現(xiàn)顯著的單核細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤；上調(diào)組大鼠肺間質(zhì)存在大量的炎性細胞浸潤，肺組織損傷嚴(yán)重，大量肺泡出現(xiàn)萎縮、塌陷現(xiàn)象；下調(diào)組大鼠肺炎性細胞浸潤和肺泡結(jié)構(gòu)損傷減輕，肺隔膜變薄，肺泡浸潤基本恢復(fù)正常，見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)比較(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠miR-423-5p表達量比較 與空白組miR-423-5p表達量(1.08±0.34)比較，模型組(2.34±0.71)升高(t/P=6.026/0.001)；與模型組比較，上調(diào)組(3.75±1.21)升高，下調(diào)組(0.64±0.19)降低(t/P=3.366/0.003、8.620/0.001)，且下調(diào)組低于上調(diào)組(t/P=9.513/0.001)。

2.3 各組大鼠血清CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平比較 與空白組比較， 模型組CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平均升高(t/P=10.900/0.001、10.050/0.001、8.267/0.001)；與模型組比較，上調(diào)組上述指標(biāo)均升高，下調(diào)組均降低(t/P=2.992/0.008、3.521/0.002、2.694/0.014，3.443/0.002、2.416/0.024、2.279/0.032)，且下調(diào)組均低于上調(diào)組(t/P=5.936/0.001、5.819/0.001、4.833/0.001)，見表1。

表1 各組大鼠血清CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平比較

2.4 各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高(t/P=6.519/0.001、8.841/0.001、10.630/0.001)；與模型組比較，上調(diào)組上述指標(biāo)均升高，下調(diào)組均降低(t/P=2.277/0.033、2.822/0.010、2.727/0.034，2.622/0.015、5.369/0.001、2.433/0.023)，且下調(diào)組均低于上調(diào)組(t/P=4.465/0.001、7.416/0.001、4.114/0.001)，見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.5 各組大鼠TGF-β/Smad信號通路蛋白表達量比較 與空白組比較，模型組TGF-β1、COl-1、Smad2/3、Vimentin蛋白表達量均升高(t/P=5.921/0.001、7.920/0.001、4.979/0.001、5.236/0.001)；與模型組比較，上調(diào)組以上指標(biāo)均升高，下調(diào)組均降低(t/P=2.936/0.008、3.666/0.001、2.461/0.023、2.519/0.020，5.443/0.001、3.140/0.005、3.071/0.005、2.455/0.022)，且下調(diào)組均低于上調(diào)組(t/P=7.320/0.001、6.479/0.001、5.504/0.001、4.880/0.001)，見表3、圖3。

圖3 各組大鼠TGF-β/Smad信號通路蛋白印跡比較

表3 各組大鼠TGF-β/Smad信號通路蛋白表達量比較

3 討 論

肺癌腦轉(zhuǎn)移是臨床常見而嚴(yán)重的疾病，其原因多為肺組織淋巴和供血豐富，癌細胞易從鄰近的淋巴管或血管轉(zhuǎn)移至遠處器官，肺血管和椎靜脈間常有吻合支，脫落的肺癌細胞可不經(jīng)肺部毛細血管的過濾而直接入腦，增大其轉(zhuǎn)移至腦部的幾率[7-8]。miRNA是部分哺乳動物體內(nèi)一類單鏈分子，對蛋白編碼基因具有調(diào)控作用。miR-423-5p起初在心力衰竭等疾病中發(fā)現(xiàn)，孫麗麗等[9]研究中，miR-423-5p來源于心肌細胞，且在慢性心力衰竭患者體內(nèi)水平顯著升高，提示其可能參與慢性心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，具有較高敏感度，可作為評估病情嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物，且其水平越高，提示心力衰竭進展較快。有研究顯示[10]，miR-423-5p在卵巢癌中呈高表達，其原因可能為其可提高癌細胞的克隆形成率及侵襲細胞比例，促進異種移植瘤的生長。在本研究中，前期工作中發(fā)現(xiàn)miR-423-5p與肺癌腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，故深入探究下調(diào)miR-423-5p通過作用于TGF-β/Smad信號通路對肺癌腦轉(zhuǎn)移模型大鼠的干預(yù)作用，可為腫瘤的早期無創(chuàng)性診斷開辟一條新途徑。

CEA屬于糖蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可參與不同類型癌癥的發(fā)病、發(fā)展過程[11]。在侯志華等[12]研究中，CEA在非小細胞肺癌伴腦轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)呈高表達，但經(jīng)治療后其水平降低，與本研究結(jié)果一致。在孫杰等[13]研究中，CEA可作為肺癌的腫瘤標(biāo)志物，且其水平變化與腫瘤細胞的增殖相關(guān)，腫瘤晚期其水平更高。SCC-Ag屬于腫瘤相關(guān)抗原，分布于肺部腫瘤組織中，且在鱗狀細胞癌中分布更為廣泛。在覃遠靜等[14]研究中，SCC-Ag是一種腫瘤抗原，主要存在于腫瘤病灶內(nèi)，在鱗狀細胞癌中的診斷敏感度極高。CYFRA21-1是角蛋白家族成員之一，主要儲存在復(fù)層腫瘤上皮細胞質(zhì)內(nèi)，在細胞癌變、凋亡或溶解后會進入血液中，導(dǎo)致血液中其水平升高[15]。在趙雪蓮等[16]研究中，CYFRA21-1是一種具有較高敏感性、特異度的鱗癌標(biāo)志物，可用于判斷肺癌腦轉(zhuǎn)移及監(jiān)測發(fā)展過程。本研究結(jié)果顯示，CEA、SCC-Ag、CYFRA21-1水平與肺癌腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其原因可能為上述3個指標(biāo)均為腫瘤的重要標(biāo)志物，三者聯(lián)合對肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展預(yù)測價值更高。

TGF-β/Smad信號通路在調(diào)控干細胞活性和器官形成中具有重要作用，當(dāng)TGF-β信號通路各成員活性未激活時，體內(nèi)會自發(fā)性發(fā)生多種癌癥，這表明TGF-β定向調(diào)節(jié)干細胞對癌癥形成具有不可或缺的功能[17-18]。TGF-β1在TGF家族中為最經(jīng)典的轉(zhuǎn)化生長因子。Smad2蛋白在浸潤癌細胞、良性腫瘤細胞、癌前病變上皮細胞中呈低表達，但在結(jié)腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中呈高表達，且其水平隨腫瘤分化程度增高而增高[19-20]。在王春剛等[21]研究中，TGF-β可通過與其受體相結(jié)合，將細胞外信號傳遞至細胞內(nèi)，進而活化Smad2、Smad3與Smad4形成復(fù)合物移位至細胞核作為基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，調(diào)控腫瘤細胞的生物功能。有研究顯示[22]，上調(diào)Vimentin的表達，肺癌細胞系的遷移能力顯著增強，促進非小細胞肺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。在甘聲通等[23]研究中，TGF-β信號通路可促進上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成，促使非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移，抑制此信號通路具有良好的臨床應(yīng)用前景。本結(jié)果顯示，下調(diào)miR-423-5p可通過作用于TGF-β/Smad信號通路，阻斷延緩肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，其原因可能為下調(diào)miR-423-5p對TGF-β/Smad信號通路相關(guān)信號分子具有抑制作用，阻礙此信號通路的激活、細胞外信號傳遞至細胞內(nèi)，抑制腫瘤細胞生物活性。

綜上所述，下調(diào)miR-423-5p可能通過作用于TGF-β/Smad信號通路，下調(diào)TGF-β1、COl-1、Smad2/3、Vimentin蛋白表達量，減輕炎性反應(yīng)，抑制肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

楊成、魏亮：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王光學(xué)、張燕飛：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文修改;管宏新：實施研究過程，資料搜集整理，論文撰寫，統(tǒng)計學(xué)分析;鐘春龍、李欽傳：課題設(shè)計，論文審核