馬飛躍　耿炬　喬健　帥希祥　張明　杜麗清

摘 ?要：為了研究不同品種桑葚葉的總酚含量差異及應(yīng)用價(jià)值，以收集引種的40個(gè)品種桑葚葉為研究對(duì)象，采用超聲波輔助提取桑葚葉中酚類物質(zhì)，以總酚提取率為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察各因素對(duì)超聲輔助提取桑葚葉總酚提取率的影響;采用DPPH自由基清除能力評(píng)價(jià)不同品種桑葚葉提取物的抗氧化能力，同時(shí)對(duì)不同品種桑葚葉中總酚含量及其抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：超聲輔助提取桑葚葉總酚的最佳工藝條件為：超聲溫度65 ℃、超聲時(shí)間30 min、固液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度60%，4個(gè)因素對(duì)桑葚葉總酚提取率影響大小順序?yàn)椋撼暅囟?超聲時(shí)間>固液比>乙醇濃度。不同品種桑葚葉總酚含量差異較大，其中‘條桑五號(hào)總酚含量最高，為（26.35 ± 0.29）mg/g，‘滇?？偡雍孔畹停瑸椋?0.44 ± 0.15）mg/g;不同品種桑葚葉抗氧化活性也存在差異，且趨勢(shì)與總酚含量基本一致，‘條桑五號(hào)桑葚葉抗氧化活性最強(qiáng)，清除DPPH自由基能力IC50為（77.64 ± 0.34）mg/L，總抗氧化能力（FRAP）TEAC值為（2.58 ± 0.11）mmol/g;‘滇桑桑葚葉抗氧化活性最弱，清除DPPH自由基能力IC50為（210.30 ± 0.19）mg/L，總抗氧化能力（FRAP）TEAC值為（0.73 ± 0.04）mmol/g。桑葚葉總酚含量與其提取物抗氧化能力呈正相關(guān)，選擇總酚含量高的桑葚品種栽培，可提高桑葚的綜合附加值。

關(guān)鍵詞：不同品種桑葚葉;總酚;抗氧化

中圖分類號(hào)：Q949.9;S663.9 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Comparison of Total Phenol Content and Antioxidant Activity from Different Mulberry Leaves

MA Feiyue， GENG Ju， QIAO Jian， SHUAI Xixiang， ZHANG Ming， DU Liqing*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract： In order to compare the contents of total phenol in different mulberry leaves and the different application， single-factor experiments and a four-variable， three-level orthogonal array design were performed to study on the extraction of total phenols from 40 mulberry leaves. The optimal conditions were： temperature 65 ℃， time 30 min， solid/liquid ratio 1∶45 （g/mL）， and ethanol concentration 60%. The effect of extraction condition were temperature > time > solid/ liquid ratio > ethanol concentration. Under the optimal conditions， the highest content of total phenol in ‘Tiaosang 5 mulberry leaves was （26.35 ± 0.29） mg/g. The least content of total phenol in ‘Diansang mulberry leaves was （20.44 ± 0.15） mg/g. Furthermore， the most antioxidant activity of the extracts from ‘Tiaosang 5 mulberry leaves and lowest one from ‘Diansang mulberry leaves was （77.64 ± 0.34） mg/L and （210.30 ± 0.19） mg/L （IC50）， respectively， according to the DPPH radical-scavenging assay. According to the FRAP， TEAC of ‘Tiaosang 5 mulberry leaves and ‘Diansang mulberry leaves was （2.58 ± 0.11） mmol/g and （0.73 ± 0.04） mmol/g， respectively. The total phenol content was positively correlated with the capacity of DPPH radical scavenging. Choosing varieties with high total phenol content in mulberry leaves could improve the economic values of mulberry.

Keywords： different mulberry leaves; total phenol; antioxidant activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.03.039

桑葚（Folium Mori），?？坡淙~灌木或小喬木植物，別名家桑、荊桑、桑葚樹、黃桑葉、桑棗樹等[1-3]。全球50%的國家種植桑樹，主要分布于中國、韓國及日本等國家，而我國是最大的桑樹種植國。桑葚葉是桑樹的主要產(chǎn)物、蠶的日常食物，產(chǎn)量豐富[4]。完整葉片呈卵形、寬卵形、心形、圓狀形等，單葉互生，上表面無毛，有光澤，下表面綠色，脈上有疏毛[5]。桑葚葉營養(yǎng)成分非常豐富，主要成分有黃酮類、生物堿、植物甾醇、-氨基丁酸、桑葉多糖等[4， 6-9]。桑葚葉中的營養(yǎng)成分隨桑葚品種、采收時(shí)間、產(chǎn)地等有明顯不同。桑葚葉具有抗衰老、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、抑菌、抗炎、降血脂、降膽固醇、降血壓等藥用價(jià)值[10-12]，同時(shí)具有養(yǎng)顏、美容之功效。在中國就有桑葉制茶的歷史，譽(yù)為“神仙茶”，而在日本則被稱為“長壽茶”[13-14]。

每年為果實(shí)增產(chǎn)而進(jìn)行短截修枝而產(chǎn)生大量桑葚葉，桑葚葉占桑園年產(chǎn)干物質(zhì)量的36%左右[13]。桑葉雖主要用于傳統(tǒng)的養(yǎng)蠶業(yè)和制茶業(yè)，但供大于求，造成嚴(yán)重資源浪費(fèi)[15]，如何充分利用桑葚產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，為農(nóng)民增產(chǎn)增收，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化可持續(xù)發(fā)展是現(xiàn)階段的關(guān)鍵問題。而目前為響應(yīng)國家政策，以可持續(xù)發(fā)展為戰(zhàn)略目標(biāo)，以采摘、親子游等形式的休閑農(nóng)業(yè)蓬勃發(fā)展，桑葚作為主要模式果樹品種，其品種繁多，且多數(shù)研究主要集中在不同品種果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)和比較方面，甚少關(guān)于不同品種間桑葚葉活性成分含量差異比較、抗氧化活性差異比較的研究，忽視了桑葚葉的價(jià)值，大大降低了其綜合附加值。因此對(duì)桑葚葉全面、高效地開發(fā)和利用，進(jìn)一步發(fā)掘其經(jīng)濟(jì)附加值是急需解決的重要問題之一。

為了比較品種間桑葚葉活性成分含量與抗氧化活性的差異，本試驗(yàn)以超聲波輔助提取法提取不同品種桑葚葉中的總酚，并優(yōu)化其提取條件;采用清除DPPH自由基測(cè)定方法對(duì)桑葚葉提取物抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià);比較不同品種桑葚葉總酚含量和抗氧化能力，為桑葚葉資源的進(jìn)一步開發(fā)利用，增加桑葚綜合附加值提供數(shù)據(jù)支持，并對(duì)桑葚深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論指導(dǎo)，為桑葚品種栽培開辟了新的思路。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

原料：40種不同品種桑葚葉，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所桑葚種植基地。品種名稱及編號(hào)見表1。

試劑：DPPH，購自Sigma公司;維生素C（>99.0%），河北源創(chuàng)生物科技有限公司;沒食子酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;福林酚（1 mol/L），源葉生物;其他試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：高速藥材調(diào)料粉碎機(jī)，F(xiàn)Z-06，浙江溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Heidolph Hei-VAP Preciscion，德國海道爾夫公司;純水儀，RODI-220A1，廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司;酶聯(lián)免疫分析儀，Spark 10M，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司;超聲波提取儀，SK5210HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，MULTIFUGEXIR，美國Thermo公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?樣品溶液的制備 ?分別摘取40種不同品種桑葚葉，準(zhǔn)確稱取每個(gè)品種的鮮重，在干燥箱中（50 ℃）將其烘干至重量恒定，用粉碎機(jī)將其粉碎，密封保存于冰箱作為待測(cè)品。準(zhǔn)確稱取1.0 g待測(cè)品至錐形瓶中，加入一定濃度的乙醇溶液，密封瓶口，在不同提取溫度、乙醇濃度、時(shí)間、固液比條件下進(jìn)行提取，再過濾，得到上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，稱取質(zhì)量，再溶解定容至10 mL。

1.2.2 ?提取方法 （1）超聲波輔助提取方法。選擇廣泛種植的品種‘大十，作為優(yōu)化提取工藝的材料。準(zhǔn)確稱取1.0 g‘大十桑葚葉至錐形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液，錐形瓶用封口膜封口，在30 ℃超聲提取20 min。過濾取上清液，重復(fù)提取3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，稱量，再溶解定容至10 mL，測(cè)定其中總酚含量，計(jì)算提取率。

（2）傳統(tǒng)提取方法。準(zhǔn)確稱取1.0 g‘大十桑葚葉至錐形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液，錐形瓶用封口膜封口，在30 ℃水浴中提取20 min，提取結(jié)束后操作同上。

1.2.3 ?桑葚葉總酚提取的單因素實(shí)驗(yàn) ?（1）乙醇濃度對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.0 g‘大十桑葚葉至錐形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入不同濃度（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的乙醇溶液，錐形瓶用封口膜封口，在30 ℃超聲提取20 min。過濾取上清液，重復(fù)提取3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，稱量，再溶解定容至10 mL，測(cè)定其中總酚含量，計(jì)算提取率。

（2）超聲溫度對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.0 g‘大十桑葚葉至錐形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入60%的乙醇溶液，錐形瓶用封口膜封口，在不同超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）下超聲提取20 min。過濾取上清液，重復(fù)提取3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，稱量，再溶解定容至10 mL，測(cè)定其中總酚含量，計(jì)算提取率。

（3）超聲時(shí)間對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.0 g‘大十桑葚葉至錐形瓶中，按固液比1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，錐形瓶用封口膜封口，在60 ℃下超聲提取不同時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）。過濾取上清液，重復(fù)提取3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，稱量，再溶解定容至10 mL，測(cè)定其中總酚含量，計(jì)算提取率。

（4）固液比對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.0 g不同品種的桑葚葉至錐形瓶中，按不同固液比[1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）]加入60%乙醇溶液，錐形瓶用封口膜封口，在60 ℃超聲提取30 min。過濾取上清液，重復(fù)提取3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，稱量，再溶解定容至10 mL，測(cè)定其中總酚含量，計(jì)算提取率。

1.2.4 ?桑葚葉總酚提取的正交實(shí)驗(yàn) ?在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）四因素三水平正交試驗(yàn)，以獲得超聲輔助提取桑葚葉總酚最佳工藝條件。因素水平表見表2。

1.2.5 ?總酚含量測(cè)定 ?（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密稱取沒食子酸，溶于水中，配制成濃度為50、100、150、250、500、1000 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。采用福林酚法[16]測(cè)定總酚，略作修改：分別移取0.20 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入1.00 mL福林酚試劑（0.1 mol/L）和0.80 mL純水，混勻，靜置5 min，然后加入1.00 mL Na2CO3溶液（7.5%），充分混勻。避光反應(yīng)2 h，在765 nm處測(cè)定吸光度。以沒食子酸濃度作為橫坐標(biāo)（X），吸光度作為縱坐標(biāo)（Y），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=2078.9X-122.21（R2=0.998）。

（2）樣品中總酚含量測(cè)定。準(zhǔn)確吸取定容后的桑葚葉提取液0.20 mL，按上述方法操作，在765 nm下測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算桑葚葉總酚提取率。桑葚葉中總酚提取率和不同品種桑葚葉總酚含量計(jì)算公式：總酚提取率= 100%× CV/M;不同品種桑葚葉總酚含量（mg/g）= CV/M。其中，C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得樣品總酚含量，mg/L;V為定容的體積，L;M為稱取桑葚葉的質(zhì)量，g。

1.2.6 ?抗氧化活性測(cè)定方法 ?（1）DPPH清除能力測(cè)定。準(zhǔn)確移取按照1.2.1制備的樣品溶液各0.1 mL，其具體操作參考Ma等[17]的方法。對(duì)不同品種的桑葚葉提取物進(jìn)行（清除DPPH自由基能力）抗氧化活性測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以VC作為對(duì)照。

（2）總抗氧化能力（FRAP法）測(cè)定。準(zhǔn)確移取按照1.2.1制備的樣品溶液，與200 μL FRAP工作液（按照試劑盒操作步驟配置）混合均勻后，在37 ℃水浴條件下孵育5 min，之后在517 nm下進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品平行重復(fù)3次。具體操作方法和計(jì)算公式均參照碧云天試劑盒方法[總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法）]進(jìn)行。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Origin 8.0軟件對(duì)分析后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 ?結(jié)果和分析

2.1 ?提取方法對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響

由圖1可知，在相同的提取條件下，與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲波輔助提取法所得桑葚葉總酚提取率顯著提高（P<0.05）。這可能是因?yàn)槌暡ǖ膹?qiáng)大剪切力可以破壞桑葚葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而增加目標(biāo)化合物的溶出，且超聲波輔助也可增加目標(biāo)化合物的溶解速度，增強(qiáng)擴(kuò)散傳質(zhì)，因此導(dǎo)致桑葚葉總酚的提取率增加。故選擇超聲波輔助提取法作為桑葚葉總酚提取的方法。

2.2 ?超聲輔助提取桑葚葉總酚工藝優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 ?乙醇濃度對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響 ?從圖2可知，桑葚葉總酚提取率隨乙醇濃度增大呈現(xiàn)先增加后略降低的趨勢(shì)，乙醇濃度為0～50%時(shí)，桑葚葉總酚提取率逐步增加，在乙醇濃度為60%～80%時(shí)，總酚提取率總體差異不顯著，基本保持不變，在>80%后，略有降低。一方面可能是由于溶液的介質(zhì)常數(shù)隨著乙醇濃度的不斷增加而減少，這使得傳質(zhì)所需的能量減少，溶質(zhì)分子更易進(jìn)入溶劑，且溶劑極性與多酚物質(zhì)極性相似度增加，增加了多酚物質(zhì)的溶解度;另一方面，水能使植物細(xì)胞的膨脹增強(qiáng)，又增大了材料與溶劑的接觸面積，更易破壞植物細(xì)胞。同時(shí)，多酚的活性官能團(tuán)羥基較易與水以氫鍵結(jié)合，而其他基團(tuán)既可以溶于水又可被乙醇提取。因此，適當(dāng)比例水的存在可以促進(jìn)目標(biāo)化合物提取率的增加[18-20]。綜上所述，從經(jīng)濟(jì)層面上考慮，選擇乙醇濃度55%、60%、65%作為正交試驗(yàn)中乙醇濃度的因素水平。

2.2.2 ?超聲溫度對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響 ?從圖3可知，總酚提取率隨溫度升高呈現(xiàn)先增加再達(dá)到平穩(wěn)的趨勢(shì)，在超聲溫度30～50 ℃時(shí)桑葚葉總酚提取率逐步增加，在溫度>60 ℃時(shí)，總酚提取率基本保持一致。這可能是因?yàn)闇囟壬邔?duì)桑葚葉總酚的溶出傳質(zhì)起到了促進(jìn)的作用，桑葚葉總酚提取率隨著溫度的升高而增加[21]，而當(dāng)溫度達(dá)到了臨界值時(shí)，則不會(huì)繼續(xù)升高。因此，超聲溫度選擇55、60、65 ℃作為正交試驗(yàn)中超聲溫度的因素水平。

2.2.3 ?超聲時(shí)間對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響 ?從圖4可知，在10～30 min內(nèi)，桑葚葉總酚提取率隨著超聲時(shí)間的延長而增加，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，其提取率略有下降，但變化差異不明顯。這可能是因?yàn)?，開始時(shí)隨著超聲時(shí)間變長桑葚葉總酚物質(zhì)不斷被溶出，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后桑葚葉中總酚物質(zhì)被基本溶出，即使再增加提取時(shí)間也不能達(dá)到明顯的提取效果，同時(shí)提取時(shí)間過長有可能會(huì)因?yàn)槌暡ǖ臋C(jī)械剪切力而破壞掉多酚的結(jié)構(gòu)（>40 min）[22]。這一結(jié)果與楊上鶯等[20]的研究結(jié)果相近，同樣也優(yōu)于用溶劑浸提法[23]的最優(yōu)條件（2 h）。因此，綜合考慮，選擇25、30、35 min作為正交試驗(yàn)中超聲時(shí)間的因素水平。

2.2.4 ?固液比對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響 ?從圖5可見，桑葚葉總酚提取率隨固液比的增加而增加。在固液比為1∶20～1∶40（g/mL）時(shí)桑葚葉總酚提取率逐步增加，并在固液比為1∶40（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，之后隨著固液比的繼續(xù)增加，桑葚葉總酚的提取率略有下降，但變化差異不顯著。這可能是因?yàn)殡S著溶劑用量的增大，細(xì)胞內(nèi)外的目標(biāo)物質(zhì)濃度差不斷提高，使得桑葚葉中總酚的傳質(zhì)驅(qū)動(dòng)力增大，從而提高提取率。該結(jié)果與楊上鶯等[20]和丁雙華等[23]的研究結(jié)果相似，因此，從節(jié)省溶劑消耗，降低提取成本角度考慮，選擇1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）的固液比作為正交試驗(yàn)中固液比的因素水平。

2.3 ?桑葚葉總酚提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以桑葚葉總酚提取率為指標(biāo)，選擇超聲溫度（A）、乙醇濃度（B）、超聲時(shí)間（C）、固液比（D）共4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，確定超聲輔助提取桑葚葉總酚的最佳提取條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表3和表4。

由表3極差分析和表4方差分析得出影響桑葚葉總酚提取率的主次因素依次為：提取溫度>提取時(shí)間>固液比>乙醇濃度。同時(shí)，由表3極差分析可知，最佳提取工藝條件為：A3B2C2D3，即超聲溫度為65 ℃、乙醇濃度為60%、超聲時(shí)間為30 min、固液比為1∶45（g/mL）。最佳提取工藝條件不在正交實(shí)驗(yàn)表內(nèi)，需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。以最佳條件為A3B2C2D3對(duì)桑葚葉總酚進(jìn)行提取，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，提取率為2.30% ± 0.043%。再以最佳條件做加樣回收率實(shí)驗(yàn)，在提取前加入一定量的沒食子酸（表5），計(jì)算平均回收率為98.93%，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.4 ?不同品種桑葚葉中總酚含量及抗氧化活性的比較

2.4.1 ?不同品種桑葚葉總酚含量的比較 ?以2.3優(yōu)化的桑葚葉總酚提取的最佳工藝條件，對(duì)40種不同品種桑葚葉總酚進(jìn)行提取，并測(cè)定總酚含量。從圖6可知，不同品種桑葚葉之間總酚含量差異較大。其中‘條桑五號(hào)總酚含量最高為（26.35 ± 0.29）mg/g，‘滇?？偡雍孔畹蜑椋?0.44 ± 0.15）mg/g，該結(jié)果范圍與其他研究結(jié)果一致[24-27]。其中紅果系列，條桑系列，雜交品種‘果桑8632以及一些葉果兩用品種（如白玉王）其總酚含量較高。而適宜南方種植，抗病性較強(qiáng)，且在廣東省內(nèi)湛江市等地廣泛種植的品種‘大十，雖然葉片較大，產(chǎn)量較高，但其總酚含量則處于40種桑葚品種的中下水平。

2.4.2 ?不同品種桑葚葉提取物抗氧化活性比較 ?（1）DPPH清除能力。不同品種桑葚葉提取物對(duì)DPPH自由基清除能力以IC50表示，由圖7可知，‘條桑五號(hào)桑葚葉的IC50最低，為（77.64 ± 0.34）mg/L，‘滇桑桑葚葉的IC50最高，為（210.30 ± 0.19）mg/L。IC50值越小，其抗氧化能力越強(qiáng)，因此，‘條桑五號(hào)桑葚葉提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，且還略強(qiáng)于Vc [IC50 值為（81.62 ± 0.12）mg/L]。其他品種桑葚葉的抗氧化能力與總酚含量趨勢(shì)基本保持一致。桑葚葉總酚含量與其提取物抗氧化能力呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.957，P<0.01），總酚含量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)，尤其‘條桑五號(hào)桑葚葉提取物可開發(fā)用作天然抗氧化劑。可見，不同品種桑葚葉提取物抗氧化活性雖然差異較大，但整體均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，同時(shí)一些品種尤為突出，與高欣妍等[28]的研究結(jié)果相近。

（2）總抗氧化能力（FRAP）。用TEAC值，即FeSO4當(dāng)量來表示不同品種桑葚葉總抗氧化能力。由圖8可知，‘條桑五號(hào)桑葚葉的TEAC最高，為（2.58 ± 0.11）mmol/g，‘滇桑桑葚葉的最低，為（0.73 ± 0.04）mmol/g，因此，‘條桑五號(hào)桑葚葉提取物的抗氧化能力最強(qiáng)。總體趨勢(shì)與清除DPPH自由基抗氧化能力以及總酚含量趨勢(shì)基本保持一致。桑葚葉總酚含量與其提取物總抗氧化能力（FRAP）呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.992，P<0.01）。

3 ?討論

本研究利用超聲波輔助提取方法，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)‘大十品種桑葚葉總酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其最佳工藝條件為：超聲溫度65 ℃、乙醇濃度60%、超聲時(shí)間30 min、固液比1∶45（g/mL），且各因素對(duì)桑葚葉總酚提取率的影響次序?yàn)椋撼暅囟?超聲時(shí)間>固液比>乙醇濃度，在此條件下，桑葚葉總酚的提取率為2.30% ± 0.043%。與丁雙華等[23]、劉詠等[29]和沈維治等[30]采用溶劑浸提法提取桑葚葉多酚工藝相比，明顯縮短了提取時(shí)間，且提取率更高;張宇思等[27]對(duì)超聲波提取桑葚葉中活性成分的研究也發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲波提取技術(shù)具有提取時(shí)間短，操作方便，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，采用該方法對(duì)40個(gè)品種桑葚葉中酚類化合物進(jìn)行提取，并比較不同品種的總酚含量。結(jié)果表明，不同品種桑葚葉總酚含量范圍為（20.44 ± 0.15）～（26.35 ± 0.29）mg/g，其中‘條桑五號(hào)總酚含量最高，‘滇?？偡雍孔畹?。

對(duì)于不同品種桑葚葉提取物清除DPPH自由基的能力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，‘條桑五號(hào)桑葚葉提取物抗氧化活性最強(qiáng)，高于Vc，IC50值為（77.64 ± 0.34）mg/L，‘滇桑桑葚葉提取物抗氧化活性最弱，IC50值為（210.30 ± 0.19）mg/L。‘條桑五號(hào)桑葚葉提取物總抗氧化能力（FRAP）TEAC值為（2.58 ± 0.11）mmol/g;‘滇桑桑葚葉提取物總抗氧化能力（FRAP）TEAC值為（0.73 ± 0.04）mmol/g。不同品種桑葚葉總酚含量與抗氧化能力之間存在較大差異。與高欣妍等[28]DPPH清除自由基的抗氧化能力測(cè)定結(jié)果相近，均高于Vc。與其他研究結(jié)果[31-32]相比，本研究中大部分品種桑葚葉提取物抗氧化能力更強(qiáng)。且桑葉中總酚含量與其抗氧化能力之間存在相關(guān)性，說明桑葚葉總酚是其抗氧化作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。馮淦熠等[21]總結(jié)前人研究結(jié)果同樣得出相似的結(jié)論，桑葚葉的總酚含量可以用作不同品種桑葚葉抗氧化能力的參考標(biāo)準(zhǔn)。但并不是所有品種桑葚葉中總酚含量與抗氧化能力之間存在完全對(duì)應(yīng)的線性關(guān)系，一方面可能是因其提取物中含有其他類的抗氧化活性物質(zhì);另一方面不同品種桑葚葉間的酚類物質(zhì)品種和含量存在多樣性，彼此之間可能存在一定的協(xié)同效應(yīng)，一定程度上增強(qiáng)了其抗氧化能力。根據(jù)品種間所表現(xiàn)出來的不同差異性，不同品種桑葚葉的利用價(jià)值也不同，如飼料，藥用價(jià)值方面等。紅果系列，條桑系列以及一些葉果兩用的桑葚品種葉子多數(shù)較大，或葉片較肥厚，其總酚含量較高，在果實(shí)鮮食的同時(shí)，葉子具有較高的抗氧化活性，可用作生產(chǎn)天然抗氧化劑來提高桑葚產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，或用作高品質(zhì)飼料桑的生產(chǎn)[15]，并可通過超聲波提取方法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。作為觀賞品種的九曲龍桑，葉片較小且薄，桑葉產(chǎn)量較低，其總酚含量和抗氧化能力也同樣處于中下水平，但并不是所有果葉兩用，葉片較大、產(chǎn)量較多的桑葚品種均適宜用于天然抗氧化劑生產(chǎn)，可根據(jù)不同用途和需求，選擇栽培種植相應(yīng)的桑葚品種。

由于國際蠶絲貿(mào)易發(fā)展出現(xiàn)滑坡，蠶桑業(yè)的發(fā)展受阻，我國在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)方面作出了較大調(diào)整[13]。不斷調(diào)整桑葚的利用結(jié)構(gòu)，增加其生物利用率，根據(jù)不同品種桑葚葉中物質(zhì)含量差異來探索桑葚的新用途，是進(jìn)一步促進(jìn)桑葚綜合開發(fā)和利用的關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)

[1] 欒琳琳， 盧紅梅， 陳 ?莉. 桑葚花青素提取純化研究進(jìn)展[J]. 中國調(diào)味品， 2019， 44（3）： 156-160， 164.

[2] 喻 ?艷， 逯海朋， 賈亞楠， 等. 桑椹中酚類物質(zhì)極性分布及抗氧化活性評(píng)價(jià)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2017， 43（1）： 73-79.

[3] 喬 ?宇， 呂輝華， 吳繼軍， 等. 不同品種桑椹中糖酸組成和甜酸風(fēng)味評(píng)價(jià)[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)， 2016， 34（4）： 44-49.

[4] 王婷婷， 馬天宇， 李 ?琪， 等. 桑葉化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品， 2018， 20（5）： 390-393.

[5] 楊 ?燕. 桑葉化學(xué)成分和生物活性研究[D]. 北京： 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)， 2010.

[6] 劉新湘， 梁逸曾. 桑葉揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析[J]. 中國科技論文在線， 2006， 1（1）： 7 9-82.

[7] Asano N， Tomioka E， Kizu H， et al. Sugars with nitrogen in the ring isolated from the leaves of Morus bombycis[J]. Carbohydrate Research， 1994， 253： 235-245.

[8] 諶 ?珍， 劉青茹， 張曉偉， 等. 高效液相色譜法測(cè)定桑葉-氨基丁酸和谷氨酸[J]. 食品研究與開發(fā)， 2019， 40（3）： 162-166.

[9] 王瑞嫻， 楚 ?渠， 禚 ?蘇， 等. 15份桑葉中多糖和γ-氨基丁酸含量的測(cè)定[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 64（10）： 74-75， 99.

[10] Kim S Y， Gao J J， Lee W C， et al. Antioxidative flavonoids from the leaves of Morus alba[J]. Archives of Pharmacal Research， 1999， 22（1）： 81-85.

[11] 吳勝芳， 王樹英， 湯 ?堅(jiān). 桑葉的生物功能特性及其應(yīng)用[J]. 食品科技， 2003（10）： 95-97， 90.

[12] 莊 ?愉， 盛家鏞. 桑葉藥用價(jià)值與應(yīng)用[J]. 江蘇蠶業(yè)， 2013， 35（2）： 28-31.

[13] 許淑瓊， 葉建美. 桑葉綜合利用現(xiàn)狀及發(fā)展方向[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 56（22）： 4221-4224.

[14] 金豐秋， 金其榮. 新型功能性飲品──桑茶[J]. 食品科學(xué)， 2000（1）： 46-48.

[15] 張 ?媛. 桑葉的營養(yǎng)成分和食用藥用開發(fā)價(jià)值研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2012（22）： 264-266.

[16] Anwesa C， Sanjib R. In vitro free radical scavenging activities of aerial parts aqueous extract and extract fractions of Ampelocissus latifolia （Roxb.） Planch in relation to total phenolics and flavonoid contents[J]. Journal of King Saud University Science， 2020， 32（1）： 732-739.

[17] Ma F Y， Gu C B， Li C Y， et al. Microwave-assisted aqueous two-phase extraction of isoflavonoids from Dalbergia odorifera T. Chen leaves[J]. Separation and Purification Technology， 2013， 115： 136-144.

[18] Wang J， Sun B G， Cao Y P， et al. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran[J]. Food Chem， 2008， 106（2）： 804-810.

[19] Momark M， Hasan M， Daud W R W， et al. Extraction of hydrolysable tannins from Phyllanthus niruri Linn.： Effects of solvents and extraction methods[J]. Separation and Purification Technology， 2007， 52（3）： 487-496.

[20] 楊上鶯， 賈冬英， 遲原龍， 等. 超聲波輔助乙醇提取桑葉多酚的工藝條件優(yōu)化[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2013， 39（6）： 1155-1159.

[21] 馮淦熠， 賀 ?喜， 楊浩然， 等. 桑葉多酚提取與體外抗氧化能力研究進(jìn)展[J]. 飼料研究， 2019， 42（2）： 68-72.

[22] 廖維良， 趙美順， 楊 ?紅. 超聲波輔助提取技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2012， 28（3）： 347-350.

[23] 丁雙華， 葉立斌， 陳 ?衛(wèi)， 等. 響應(yīng)面優(yōu)化提取桑葉多酚的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)， 2012， 12（1）： 52-58.

[24] 趙東曉， 李公存， 董亞茹， 等. 不同雜交桑品種桑葉活性物質(zhì)含量的測(cè)定及藥用品質(zhì)綜合評(píng)價(jià)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 51（12）： 100-105.

[25] 俞燕芳， 黃金枝， 王軍文， 等. 霜后桑葉總酚、黃酮和總糖含量變化研究[J]. 蠶桑茶葉通訊， 2017（6）： 1-4.

[26] 俞燕芳， 杜賢明， 黃金枝， 等. 不同產(chǎn)地桑葉總酚、黃酮含量及抗氧化活性比較[J]. 蠶桑茶葉通訊， 2017（2）： 1-3.

[27] 張宇思， 周 ?昊， 顏新培， 等. 桑葉多酚的研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源， 2015， 34（5）： 35-37， 50.

[28] 高欣妍， 王海英， 劉志明. 桑葉乙醇提取物的體外抗氧化與抑菌活性[J]. 生物質(zhì)化學(xué)工程， 2019， 53（2）： 35-40.

[29] 劉 ?詠， 行春麗， 成戰(zhàn)勝， 等. 從桑葉中提取多酚、黃酮和多糖的優(yōu)化試驗(yàn)[J]. 林產(chǎn)化工通訊， 2005， 39（1）： 10-13.

[30] 沈維治， 廖森泰， 劉吉平， 等. 用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化桑葉多酚的提取工藝[J]. 蠶業(yè)科學(xué)， 2009， 35（3）： 594-598.

[31] 王振偉， 金 ?敏， 吳舒儀， 等. 桑葉多酚含量顯色條件的優(yōu)化測(cè)定及醇提物抗氧化活性初探[J]. 食品科技， 2020， 45（1）： 294-300.

[32] 王麗娟. 桑葉提取物抑菌活性及抗氧化活性的研究[D]. 杭州： 浙江工業(yè)大學(xué)， 2012.

責(zé)任編輯：沈德發(fā)

收稿日期 ?2020-04-24;修回日期 ?2020-05-26

基金項(xiàng)目 ?海南省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（No. 320QN320）;廣東省優(yōu)稀水果現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（No. 2021KJ116）。

作者簡介 ?馬飛躍（1987—），女，碩士，助理研究員，研究方向：熱帶果樹功能成分及其生物活性研究與利用。*通信作者（Corresponding author）：杜麗清（DU Liqing），E-mail：mfyflc@yahoo.com。