聶小偉，陳志兵，顧曉慧，王曉玲，張 芹，任召珍，吳晴晴，王 磊

(威海海洋職業(yè)學院食品工程系，山東 威海 264300)

海帶是一種藥食同源的海洋巨藻，山東半島是我國海帶的主要產(chǎn)區(qū)[1-2]。目前，除少部分用于提取碘、甘露醇、海藻膠等產(chǎn)品深加工外，大部分以粗加工產(chǎn)品，如即食涼菜、鹽漬、海帶結和干制品為主，可以預見海帶深加工將在我國具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。而海帶在加工過程中，會產(chǎn)生大量加工邊角料，造成資源浪費。如何充分利用海帶資源，提升其附加值，推動海帶加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，成為廣大學者研究的熱點。

研究表明，在海帶細胞間和細胞內(nèi)存在一類天然生物大分子物質——海帶多糖(包括海帶海藻酸、褐藻糖膠、昆布多糖等)，從海帶中分離出的海帶多糖具有增強免疫力、抗癌和防癌等功效，同時在抗凝血、抗病毒、減肥、降血糖和降血脂等方面具有顯著功效[3-7]。

目前，國內(nèi)外學者提取海帶多糖采用的主要方法有水提醇沉法、酸提法、堿提法、超聲波法和酶解法等。水提醇沉法簡單經(jīng)濟，但海帶多糖提取率較低，并且長時間高溫會導致海帶多糖結構破壞[8]；堿提法和酸提法易導致海帶多糖降解，功能活性喪失[9-10]。而微波技術利用極性分子在電磁場中高速旋轉特性，加速活性分子溶出，具有提取率高、耗能低、時間短等優(yōu)勢[11]，在植物活性物質提取中得到廣泛應用[12]。復合酶解法可針對植物細胞壁組成和結構，充分破壞植物細胞結構，條件溫和，在海帶多糖提取率顯著提高的同時，可有效保護活性物質的結構和活性[13]。近年來，將微波輔助浸提技術和生物酶解技術結合是一種新型的破壁提取方法，與傳統(tǒng)方法相比具有節(jié)能、快速、條件溫和、提取效率高等優(yōu)勢，已廣泛用于植物有效成分的提取[14]。

為改善現(xiàn)有海帶多糖提取方法的操作時間長、提取率低等不足，本研究擬結合木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶的酶解條件溫和、環(huán)保低能耗等特點與微波的高效節(jié)能等優(yōu)勢，采用微波-復合酶輔助提取海帶加工下腳料的海帶多糖，探求其最佳工藝條件，并對該方法獲取的海帶多糖體外抗氧化性能進行研究，旨在為海帶多糖的提取研究提供新方法、新思路，為海帶多糖的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

木瓜蛋白酶(酶活力為1×105U/g，下同)購自浙江多味化工食品有限公司；纖維素酶(1×105U/g)購自寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司；果膠酶(6×104U/g)購自河南華銳化工產(chǎn)品有限公司；海帶加工廢棄物購自山東海之寶生物科技有限公司；檸檬酸(食品級)購自連云港科德食品配料有限公司；磷酸氫二鈉(食品級)購自濰坊英軒實業(yè)有限公司；苯酚購自天津市瑞金特化學品有限公司；濃硫酸購自煙臺市雙雙化工有限公司；2,4,6-三吡啶基三秦(TPTZ)、七水合硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、番紅、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自國藥集團化學試劑有限公司。本研究所用分析化學試劑均為分析純。

MAS-Ⅱ plus型常壓微波合成/萃取反應工作站購自上海新儀微波化學科技有限公司，SHA-C型恒溫振蕩器購自常州國華電器有限公司，V-1800型可見分光光度計購自翔藝儀器(上海)有限公司，BT125D型電子分析天平購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，SC-3612型低速離心機購自安徽中科中佳科學儀器有限公司，RE-3000型旋轉蒸發(fā)儀購自上海亞榮生化儀器廠，SHB Ш型循環(huán)水式多用真空泵購自鄭州長城科工貿(mào)易有限公司，DS-T300型高速多功能粉碎機購自上海頂帥電器有限公司。

1.2 樣品前處理

將新鮮的海帶加工廢棄料(初加工產(chǎn)品整形邊角料，冷凍儲藏)解凍、洗凈后切成3～5 cm條狀，在60 ℃下真空干燥至水分質量分數(shù)為5%以下；冷卻至室溫，經(jīng)高速組織粉碎機粉碎后，過40目標準篩，迅速裝入自封袋置于玻璃干燥器中保存待用。

1.3 酶種類的篩選

1.3.1 纖維素酶輔助提取 稱取2.00 g按照“1.2”處理過的樣品，在預試驗基礎上，選取pH5.5的水緩沖體系(磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，下同)，在液料比40.00 mL/g，溫度55 ℃，纖維素酶添加量(2.00 g樣品中達到的酶活力，下同)3.00×103U下酶解240 min后，在80 ℃下水浴滅酶10 min，離心過濾，取上清液定容，按“1.7”方法測定計算海帶多糖提取率。試驗平行3次，其結果取平均值。

1.3.2 果膠酶輔助提取 選取pH4.0的水緩沖體系和果膠酶添加量1.80×103U，按“1.3.1”方法進行試驗。

1.3.3 木瓜蛋白酶輔助提取 選取pH6.0的水緩沖體系和木瓜蛋白酶添加量4.00×103U，按“1.3.1”方法進行試驗。

1.3.4 復合酶輔助提取 選取pH6.0的水緩沖體系，纖維素酶、木瓜蛋白酶和果膠酶添加量3.40×103U、 3.00×103U和 1.56×103U(預試驗基礎上確定上述比例)，按“1.3.1”方法進行試驗。

1.4 微波-復合酶輔助處理順序對浸提效果的影響

1.4.1 先酶解再微波處理 稱取2.00 g經(jīng)“1.2”處理的樣品，以樣品質量40倍的pH5.0的水緩沖體系為浸提介質，纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶添加量同“1.3.4”，在55 ℃下保溫酶解浸提240 min，過濾。濾渣在微波功率500 W，樣品質量30倍的pH7.5的水浸提介質中，75 ℃保溫浸提20 min，離心過濾。合并兩次上清液定容后，按“1.7”的方法測定計算海帶多糖提取率。試驗平行3次，結果取平均值。

1.4.2 微波、酶解同時處理 稱取2.00 g經(jīng)“1.2”處理的樣品，以樣品質量30倍的pH5.0的水緩沖體系為浸提介質，纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶添加量同“1.3.4”，在微波功率500 W，55 ℃下保溫浸提240 min(微波工作方式為工作1 min停歇12 min)，離心過濾。上清液定容后，按“1.7”的方法測定計算海帶多糖提取率。試驗平行3次，結果取平均值。

1.4.3 先微波再酶解處理 按“1.4.1”試驗方法和參數(shù)，先微波后酶解處理。

1.5 微波-復合酶輔助提取單因素試驗

1.5.1 微波浸提單因素試驗設計 按照“1.4”確定的方法提取海帶多糖，考察微波輔助浸提下水浸提液pH、微波溫度、微波時間、液料比以及微波功率對海帶多糖浸提效果的影響。每個因素試驗平行3次，結果取平均值。

1.5.2 酶解浸提單因素試驗設計 按照“1.3”確定的酶種類，考察微波浸提海帶殘渣酶解輔助浸提下的pH、酶解溫度、液料比、3種酶添加量、酶解時間對海帶多糖浸提效果的影響。每個因素試驗平行3次，結果取平均值。

1.6 優(yōu)化試驗設計

1.6.1 微波浸提響應面試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果，在以水為浸提介質、微波功率為400 W下，根據(jù)Box-Behnken原理，采用Design-Expert 8.0.5進行4因素3水平試驗，確定海帶多糖微波輔助浸提最佳條件[15]。以海帶多糖提取率為指標，緩沖溶液的pH、液料比、微波溫度和時間為自變量，試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面因素水平表Tab.1 Factors and levels of the response surface

1.6.2 酶解浸提正交試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果，固定液料比為40.00 mL/g，以海帶多糖提取率為評價指標，進行正交試驗設計優(yōu)化[16]，確定最佳酶添加量、pH、溫度和時間，試驗因素水平見表2。

表2 L18(37) 正交試驗因素水平選取Tab.2 Selection of L18(37) orthogonal test on factors and levels

1.7 海帶多糖提取率計算

參照徐光域等(2005)[17]運用硫酸-苯酚法測定海帶多糖，繪制標準曲線，且空白試樣以純水代替待測海帶多糖樣品進行測定，海帶多糖提取率的計算公式如下：

(1)

式(1)中：Y為海帶多糖提取率(g/kg)，C為浸提液海帶多糖濃度(mg/L)，V為測定取樣體積(mL)，F(xiàn)為測定樣品稀釋倍數(shù)，m為稱取海帶粉質量(g)。

1.8 抗氧化性測定

1.8.1 總抗氧化能力測定 參照魏碧娜(2016)繪制FeSO4標準曲線的方法[18]，求得回歸線性方程為Y=3.883 3X+0.037(r2=0.999 6)，其中Y為593 nm下吸光值，X為FeSO4濃度(mmol/L)。取海帶多糖樣品稀釋成200 mg/L的待測溶液，然后取上述待測溶液0.20 mL，再加入1.80 mL TPTZ工作溶液(稱取TPTZ樣品31.233 mg，用40 mmol/L的鹽酸定容至10 mL，即得10 mmol/L的TPTZ工作溶液)混勻后置于37 ℃水浴中保溫10 min，在593 nm處測定吸光值?？瞻捉M以超純水代替待測樣，其他條件相同。

1.8.2 羥自由基(·OH)清除能力測定 將制得的海帶多糖樣品稀釋成200 mg/L的待測溶液。以200 mg/L維生素C溶液做陽性對照，在測定管中依次加入磷酸鹽緩沖液(0.15 mol/L，pH7.4)1.00 mL，番紅溶液(360 ug/mL)1.00 mL，EDTA-Fe(2 mmol/L)0.50 mL，待測樣液1.00 mL，體積分數(shù)為3%的H2O21.00 mL，反應總體積為4.50 mL。將待測溶液混勻，在37 ℃水浴中保溫30 min；迅速冷卻至室溫，在520 nm處測定吸光值?？瞻捉M：以1.00 mL蒸餾水代替待測樣品；對照組：以1.00 mL維生素C溶液(200 mg/L)代替待測樣品[18]。其計算公式如下：

T=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100

(2)

式(2)中：T為羥自由基清除率(%)，A樣品為樣品在520 nm處吸光值，A對照為對照組在520 nm處吸光值，A空白為空白組在520 nm處吸光值。

1.8.3 DPPH自由基消除能力測定 用100%(體積分數(shù)，下同)甲醇配制濃度為120 umol/L的DPPH，用40%甲醇配制200 mg/L的海帶多糖樣品。取4 mL樣品，加入1 mL DPPH，在30 ℃水浴保溫30 min，517 nm處測定吸光值?？瞻捉M用40%甲醇溶液代替待測樣品[19-20]。計算公式如下：

t=(1-B樣品/B空白)×100

(3)

式(3)中：t為清除率(%)，B樣品為樣品組在517 nm處的吸光值，B空白為空白對照組在517 nm處的吸光值。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理、繪制圖表；運用Design-Expert 8.0.5軟件對響應曲面法設計試驗結果進行方程擬合、參數(shù)優(yōu)化和方差分析。

2 結果與討論

2.1 酶種類篩選

纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及復合酶分別酶解海帶制備海帶多糖的效果見圖1。3種酶的復合酶輔助提取效果最好，海帶多糖提取率達到126.38 g/kg；其次為纖維素酶和木瓜蛋白酶；果膠酶輔助提取效果最差，但海帶多糖提取率也達到94.16 g/kg。從生產(chǎn)效率和成本的角度出發(fā)，選取3種酶的復合酶輔助提取制備海帶多糖的工藝進行優(yōu)化。

2.2 微波-復合酶輔助提取順序的確定

微波輔助提取與復合酶輔助提取順序對海帶多糖提取效果的影響見圖2。先微波再復合酶輔助提取效果最好，較先復合酶輔助提取再微波和微波-復合酶同時輔助提取效果有顯著提高，其海帶多糖提取率達到176.53 g/kg。從生產(chǎn)效率的角度出發(fā)，選取先微波再復合酶輔助提取制備海帶多糖的工藝進行優(yōu)化。

圖1 不同種類酶對提取效果的影響Fig. 1 Effects of different kinds of enzymes on extraction efficiency

圖2 微波與復合酶輔助提取順序對提取效果的影響Fig. 2 Effects of microwave and compound enzyme-assisted extraction sequence on extraction efficiency

2.3 微波輔助提取響應面試驗結果

2.3.1 響應面設計方案與試驗結果 在單因素試驗研究基礎上，確定對浸提效果影響較大的pH、溫度、時間、液料比等4個因素，采用Box-Benhnken中心組合方法設計響應面試驗方案[21]。以海帶多糖提取率為響應值，響應曲面試驗設計方案及結果見表3。

表3 響應曲面分析試驗設計及結果Tab.3 Experimental design and results of the response surface

運用Design-Expert 8.0.5軟件對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸擬合，構建回歸模型，得到海帶多糖提取率與pH、溫度、時間、液料比等4個因素變量的二次多項式回歸方程：

Y=98.17+8.06A+4.08B+1.77C+8.04D

-0.90A·B+3.41A·C+2.05A·D

+2.04B·C-3.50B·D-1.95C·D-22.89A2

-6.55B2-3.87C2+0.02D2

(4)

式(4)中：A、B、C、D分別為pH、溫度、時間和液料比。

由回歸方程中一次方因素系數(shù)值大小可得出，各因素對海帶多糖提取率的影響大小順序為pH>液料比>溫度>時間。

2.3.2 回歸方程的建立及方差分析 由表4可知，回歸方程模型顯著(p<0.05)，而失擬項不顯著(p>0.05)；校正決定系數(shù)值為0.952 6，預測決定系數(shù)值為0.905 1，表明試驗結果與模型預測值聯(lián)系緊密，該回歸模型方程擬合性較好，可準確考察各因素對微波輔助浸提海帶多糖的影響。

從表4可以看出，一次項A、B、D均達到了極顯著的水平(p<0.01)，而C是不顯著的(p>0.05)，說明pH、溫度和液料比對海帶多糖提取率的影響較大，因此要得到良好的浸提效果，就應該嚴格控制浸提液的pH、溫度和液料比；而浸提時間達到一定范圍之后，對海帶多糖提取率影響不大。兩兩因素間的交互作用均不顯著(p>0.05)，表明因素之間的交互作用對海帶多糖提取率的影響不大。同時，二次項A2、B2表現(xiàn)為極顯著(p<0.01)，C2顯著(p<0.05)，而D2不顯著(p>0.05)。

表4 回歸方程的方差分析Tab. 4 Analysis of variance of regression equation

2.3.3 響應曲面分析 圖3～8是依據(jù)回歸方程繪制的海帶多糖提取率與各因素交互作用項的響應面關系圖，反映了各因素在海帶多糖提取過程中對響應值的影響。

從圖3～8可以看出，海帶多糖提取率隨pH、溫度、時間的增大而增大，達到各因素中心值以后，提取率隨各因素增大而逐漸減小。對比各圖可知，pH對海帶多糖的提取率影響最大，表現(xiàn)為圖3～8的曲面較陡，由此可知，浸提液pH大小對海帶多糖提取效果至關重要；其次是溫度，再次是液料比。而響應曲面隨微波浸提時間的變化幅度不大，說明該因素對海帶多糖提取率影響較小。

圖3～8中等高線橢圓形狀不明顯，由此可判別各因素之間的交互作用不強，驗證了回歸方程模型的方差分析是可靠的，說明響應曲面法優(yōu)化設計可以很好的預測微波溫度、時間、pH和液料比等4個因素對海帶加工下腳料中海帶多糖提取率的影響。

圖3 pH與溫度相互作用的響應面Fig. 3 Response surface plot of interaction between pH and temperature

圖4 pH與時間相互作用的響應面Fig. 4 Response surface plot of interaction between pH and time

圖5 pH與液料比相互作用的響應面Fig. 5 Response surface plot of interaction between pH and ratio of solvent to substrate

圖6 溫度與時間相互作用的響應面Fig. 6 Response surface plot of interaction between temperature and time

圖7 溫度與液料比相互作用的響應面Fig. 7 Response surface plot of interaction between temperature and ratio of solvent to substrate

圖8 時間與液料比相互作用的響應面Fig. 8 Response surface plot of interaction between time and ratio of solvent to substrate

通過回歸方程模型擬合計算出微波浸提最佳提取工藝條件為：微波功率400 W、 pH6.6、溫度60 ℃、時間12.3 min和液料比60.00 mL/g，海帶多糖提取率的理論值可達107.40 g/kg。

為試驗操作方便，將工藝條件修正如下：微波功率400 W、 pH6.5、溫度60 ℃、時間12 min和液料比60.00 mL/g，進行3次驗證性試驗，得海帶多糖的平均提取率為106.49 g/kg，相對標準偏差為0.14%，與預測值的相對誤差為0.85%，驗證值與預測值基本相符，可見運用響應曲面法優(yōu)化微波輔助提取海帶多糖的工藝條件切實可行。

按上述所得修正的最佳工藝條件對海帶多糖進行連續(xù)提取，結果表明，兩次后海帶多糖提取率為(107.52±0.16)g/kg，3次后海帶多糖提取率僅為(108.84±0.13)g/kg，可見增加微波浸提次數(shù)已無法大幅提高海帶多糖提取率，所以需要輔以其他方法來進一步使海帶多糖從細胞中溶出，進而提高海帶多糖提取率，避免資源浪費。

2.4 復合酶解輔助提取正交優(yōu)化試驗結果

以單因素試驗為基礎，選取酶解pH、溫度、時間和酶添加量(纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶)為考察因素，以海帶多糖提取率作為評價指標，通過L18(37)正交試驗，試驗結果及極差分析如表5所示。

表5 L18(37) 正交試驗方案及結果Tab. 5 L18(37) orthogonal design and the results

由表5可知，以海帶多糖提取率為評價指標，各因素對海帶多糖提取率影響的主次順序為時間>pH>果膠酶添加量>纖維素酶添加量>木瓜蛋白酶添加量=溫度。由表5直觀分析可知，酶解輔助浸提海帶多糖的最佳工藝條件為：液料比40.00 mL/g，溫度55 ℃、 pH6.0、時間105 min、纖維素酶4.00×103U、木瓜蛋白酶4.00×103U、果膠酶2.40×103U。在上述工藝條件下，海帶多糖的提取率為115.16 g/kg。

在上述最佳條件下，按照“1.3.1”方法，進行微波-復合酶輔助提取海帶多糖，得海帶多糖平均提取率為208.93 g/kg，標準偏差為0.18%，相對標準偏差為0.08%，較單獨使用微波或酶解技術浸提海帶多糖提取率有顯著提升[21-22]。同時，也說明本研究微波-復合酶輔助提取海帶多糖的工藝條件真實可靠，穩(wěn)定性較好，在實際生產(chǎn)中具有參考價值。

2.5 抗氧化性能測定

海帶多糖提取物樣品抗氧化能力結果如表6所示，測得其總抗氧化能力為0.128 0 mg/mL，對羥自由基和DPPH自由基清除率分別為64.10%和4.99%?？梢姡ㄟ^微波-復合酶輔助提取的海帶多糖提取物組分是具有還原性的多糖，總抗氧化能力顯著。對羥自由基有較強的清除能力，而對DPPH自由基的清除能力不強，可能與其濃度較低有關，但也可以作為自由基的抑制劑或清除劑的潛在抗氧化劑，有待做進一步深入研究。

表6 抗氧化能力結果Tab. 6 Results of antioxidant capacity

3 結論

通過對微波-復合酶輔助提取海帶加工下腳料中海帶多糖的工藝進行研究，最終得到微波-復合酶輔助提取海帶多糖的最佳工藝條件為：微波功率400 W、 pH6.5、溫度60 ℃、時間12 min和液料比60.00 mL/g，第二步酶解輔助浸提液料比40.00 mL/g，溫度55 ℃、 pH6.0、時間105 min、纖維素酶添加量4.00×103U、木瓜蛋白酶添加量4.00×103U、果膠酶添加量2.40×103U，在最佳工藝條件下海帶多糖的提取率可達(208.93±0.18) g/kg。因此，微波-復合酶輔助適用于海帶多糖的提取，與傳統(tǒng)酸液提取法、微波提取法及復合酶法、熱水浸提法相比，具有提取率顯著提高、總操作時間短、條件溫和、耗能低等優(yōu)點。上述參數(shù)下制得的海帶多糖清除羥自由基的能力較強，其具有的抗氧化活性，使其有望作為天然抗氧化劑和功能性產(chǎn)品而得到開發(fā)利用，成為提升海帶資源綜合開發(fā)利用水平的突破口。