李鵬飛 王蕾 李帆 程迎迎 張春兵，★

腦卒中（stroke），中醫(yī)稱之“中風(fēng)”，是好發(fā)于中老年人的一種多發(fā)病、常見病與難治病。中國卒中協(xié)會2019年發(fā)布的《中國腦卒中防治報告2018》概要顯示：近30年來，我國腦卒中的發(fā)病率以平均每年8.3%的速度不斷上升，并有明顯的年輕化趨勢［1］。臨床上，腦卒中分為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）和出血性腦卒中（hemorrhagic stroke，HS）兩大類，其中IS 作為主要類型，約占87%。目前，迫切需要尋找到高敏感、高特異的IS生物標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一種功能性非編碼RNA，其長度超過200 個核苷酸，位于細(xì)胞核和胞漿內(nèi)。已知lncRNA 有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和參與調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾等功能［2］。盡管IS 患者存在眾多差異表達(dá)的lncRNAs［3-4］，但尚未有公認(rèn)和明確的生物標(biāo)志物。本文研究了lncRNA H19 和生長阻滯特異轉(zhuǎn)錄物5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）與IS 的關(guān)系，進(jìn)一步通過體內(nèi)外實驗檢測lncRNA H19 和GAS5 在IS患者、大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠和氧糖剝奪再灌注（OGD/R）模型PC12 細(xì)胞中的表達(dá)，探討其是否可以作為IS 發(fā)病早期風(fēng)險評估以及病情判斷的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年4月22日至2019年5月15日在江蘇省中醫(yī)院確診的急性初發(fā)缺血性腦卒中患者23 例為IS 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷符合2018 版中國急性缺血性腦卒中診治指南［5］，并同時經(jīng)影像學(xué)檢查證實。排除標(biāo)準(zhǔn)：①短暫性腦缺血發(fā)作、出血性腦梗死等神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；②合并心、肺、腎、肝功能不全者；③有手術(shù)史、腫瘤病史者。同期選擇江蘇省中醫(yī)院健康體檢者33 例為對照組。排除既往有腦卒中史、手術(shù)史、頭部外傷史或神經(jīng)系統(tǒng)疾病者以及有基礎(chǔ)疾病者。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.2 標(biāo)本采集

IS 患者入院24 h 內(nèi)采集外周血2 mL（EDTA-K2抗凝），一部分抗凝血由XS-800I 全血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞數(shù)（WBC），一部分用于單個核細(xì)胞（PBMC）分離；普通促凝血2 mL，分離血清。同時收集在本院體檢的健康人外周血。

1.3 PBMC 分離

將1 mL EDTA 抗凝血與1 mL 生理鹽水混勻；2 mL Ficoll 細(xì)胞分離液（天津灝洋公司）加入到15 mL 離心管中；按照說明書提取PBMC；加入1 mL TriZol 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）渦旋混勻后-80℃保存。

1.4 生化指標(biāo)檢測

AU5800 全自動生化分析儀（美國Beckman 公司）測定血清甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、空腹血糖（GLU）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。

1.5 大鼠及分組

選擇SPF 級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（北京維通利華公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011），體重為（270±20）g，飼養(yǎng)在溫度為（22±2）℃和濕度為（55±5）%的房間中，12 h/12 h 關(guān)/開光照周期。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，每組5 只。

1.6 MCAO 模型

運用Zea Longa 改良栓線法［6］構(gòu)建大鼠MCAO模型。以Zea Longa 確立的五分法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分［6］，評分≥2 分者為造模成功，并將評分為1 分或5 分者剔除。再灌注24 h 后，麻醉大鼠，取出大腦，快速分離出約100 mg 缺血腦皮質(zhì)，置于1.5 mL 無酶EP 管中-80℃保存待測。

1.7 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)和OGD/R 模型的建立

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12 購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。含100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12 細(xì)胞，常規(guī)置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱。PC12 細(xì)胞按密度1×104/mL 接種于12 孔板，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，棄上清，更換無糖DMEM 培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿和氧濃度監(jiān)測儀置于MIC-101 型細(xì)胞缺氧裝置（美國Billups-rothenberg 公司），用含95% N2和5% CO2的混合氣體通氣（20 L/min，持續(xù)10 min），將缺氧小室置于37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。結(jié)束后，將12 孔板中液體棄去，換成正常培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h 以再灌注。同時正常培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的細(xì)胞作為對照。

1.8 RNA 提取和實時熒光定量PCR

將PBMC、腦皮質(zhì)和PC12 細(xì)胞用Trizol 提取總RNA。Biophotometer plus 核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf 公司）檢測所提取RNA 的濃度和純度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa 公司）說明書，反應(yīng)體系總體積20 μL，反轉(zhuǎn)錄體系為：4 μL 5×Prime Script buffer，1 μL Prime-Script RT mix I，1 μL Oligo dT Primer，4 μL Random 6 mers，1 μg 總RNA，DEPC 水至20 μL。反應(yīng)程序為：42℃20 min，99℃5 min，4℃5 min。實時定量PCR 檢測lncRNA H19 和GAS5 的表達(dá)水平。25 μL反應(yīng)體系為：12.5 μL TB Green Premix Ex Taq II，1 μL cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，0.5 μL ROX Reference Dye II，10 μL ddH2O。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10 min 后，95℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，循環(huán)數(shù)為35。以GAPDH 為內(nèi)參。采用Quantistudio Dx 熒光定量擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）進(jìn)行檢測分析。目的基因表達(dá)倍數(shù)按2-ΔΔCt的公式計算得到。所有反應(yīng)重復(fù)三次。所用引物序列見表1。

1.9 統(tǒng)計處理

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。采用Shapiro-Wilk 法檢驗分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組比較使用t檢驗，方差不齊時采用Welch's t 檢驗；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)［M（P25～P75）］表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料特征比較

IS 組患者與健康對照相比，年齡、性別以及TG含量上比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IS 組WBC、GLU 水平顯著增高，HDL-C、LDL-C 和TC 含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 lncRNA H19 和GAS5 在各組外周血PBMC中的表達(dá)水平

lncRNA H19 在IS 組外周血中的表達(dá)水平高于lncRNA H19 在對照組的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。和對照組相比，IS 患者PBMC 中l(wèi)ncRNA GAS5 表達(dá)顯著升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1B。

表2 兩組臨床資料特征比較［（±s），n（%）］Table 2 Demographic and clinical characteristics of IS patients and control group［（±s），n（%）］

表2 兩組臨床資料特征比較［（±s），n（%）］Table 2 Demographic and clinical characteristics of IS patients and control group［（±s），n（%）］

參數(shù)年齡（歲）男性（例數(shù)）WBC（109/L）GLU（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）對照組（n=33）61.24±1.42 16（48.48）5.85±0.23 4.88（4.57～5.31）1.41±0.04 3.36±0.11 1.75±0.18 5.08±0.12 IS 組（n=23）60.04±3.13 15（65.22）7.37±0.55 5.52（4.73～7.98）1.23±0.05 2.83±0.16 1.47±0.15 4.17±0.18 t/χ2/Z 值0.348 1.536 2.864-2.262 2.713 2.901 1.096 4.412 P 值0.73 0.22 0.01 0.02 0.01 0.01 0.28＜0.05

2.3 MCAO 模型大鼠缺血腦組織中l(wèi)ncRNA H19和GAS5 的表達(dá)

和假手術(shù)組相比，MCAO 模型大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中l(wèi)ncRNA H19 表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2A。MCAO 大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中GAS5 表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2B。

2.4 OGD/R 模型PC12 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19 和GAS5 的表達(dá)

與對照組相比，OGD/R 處理的PC12 細(xì)胞其lncRNA H19 表達(dá)倍數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3A。OGD/R 處理PC12 細(xì)胞GAS5 表達(dá)倍數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3B。

圖1 兩組PBMC lncRNA H19（A）和GAS5（B）的表達(dá)Figure 1 The expression of lncRNA H19 and Gas5 in PBMC from IS patients and control group

圖2 MCAO 模型大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)中l(wèi)ncRNA H19（A）和GAS5（B）的表達(dá)Figure 2 The expression of lncRNA H19 and GAS5 in cortex from MCAO rats and sham group

圖3 OGD/R模型PC12細(xì)胞中l(wèi)ncRNA H19和GAS5的表達(dá)Figure 3 The expression of lncRNA H19 and GAS5 in OGD/R-treated PC12 cells and control group

3 討論

腦卒中危害嚴(yán)重，尤其見于中老年人。本團(tuán)隊前期研究鑒定了IS 患者外周血差異表達(dá)miRNAs，探討了miR-106b-5p、miR-199a-5p 在診斷、治療IS 患者［7-8］的意義，但是miR-106b-5p 和miR-199a-5p 受到何種分子調(diào)控仍不清楚。

LncRNAs 是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 bp 的RNA，位于細(xì)胞核內(nèi)或胞質(zhì)中，以RNA 形式在表觀遺傳學(xué)上、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種層面調(diào)控基因的表達(dá)。

多個臨床研究和動物實驗發(fā)現(xiàn)，IS 發(fā)生后腦組織和血液中l(wèi)ncRNAs 的表達(dá)水平發(fā)生了顯著改變，可能作為IS 的潛在標(biāo)志物［9］。最近的一項研究表明，lncRNA SNHG15 和linc-FAM98A-3 在IS 患者表達(dá)升高［10］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，IS 患者PBMC 中l(wèi)ncRNA MIAT 表達(dá)升高，且升高與美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale）評分、改良RANKIN 量表（mRS）評分、腦梗死體積和預(yù)后顯著相關(guān)［11］。盡管有關(guān)lncRNAs 作為IS 診斷標(biāo)志物的研究取得了巨大的進(jìn)步，但lncRNAs 還未明確，且缺乏詳細(xì)的機(jī)制探討。

LncRNA H19 促進(jìn)或抑制IS 的作用仍存爭議。多個體外實驗結(jié)果提示，lncRNA H19 表達(dá)升高后通過引起動脈粥樣硬化［12］和激活自噬［13］促進(jìn)IS 的發(fā)生。然而，最新的研究表明，lncRNA H19 高表達(dá)可保護(hù)PC12 細(xì)胞免遭OGD/R 誘導(dǎo)的損傷［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19 在IS 中表達(dá)升高。有文獻(xiàn)報道，OGD/R 處理過的原代神經(jīng)元細(xì)胞lncRNA GAS5 表達(dá)升高，通過失活Notch1 信號通路降低神經(jīng)細(xì)胞的存活［15］。降低腦部lncRNA GAS5 的表達(dá)，可減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能［16］。這些研究提示lncRNA GAS5 高表達(dá)促進(jìn)IS 的發(fā)生。也有研究報道，lncRNA GAS5 可增加THP-1 單核細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生［17］。本文研究發(fā)現(xiàn)，GAS5在IS 患者PBMC 中表達(dá)升高。那么，lncRNA GAS5是否參與外周免疫調(diào)節(jié)值得深入研究。

本研究存在以下缺陷。樣本量少，由于入組患者基礎(chǔ)病和病因多樣，需要加大樣本量證實lncRNA H19 和GAS5 的診斷價值。尤其對于不同病因和分型的IS 患者，如能明確lncRNAs，將具有非常重要的臨床價值；缺乏IS 后PBMCs中l(wèi)ncRNA H19 和GAS5 不同時間點表達(dá)特征的研究；lncRNA H19 和GAS5 如何調(diào)控miR-106b-5p和miR-199a-5p 的表達(dá)，促進(jìn)IS 的發(fā)生，與免疫的關(guān)系如何，都是未來研究的重點。

綜上所述，lncRNA H19 和GAS5 聯(lián)合檢測有望成為IS 的一個早期輔助診斷指標(biāo)。lncRNA H19 和GAS5在IS中的作用機(jī)制和診斷價值值得深入研究。