葉澤輝 郭惠玲 陳茂生 李小悅

下呼吸道感染作為臨床中常見的呼吸道感染疾病類型，具有較高的發(fā)病率和死亡率，隨著近年來各類抗菌藥物的發(fā)明和廣泛應用，下呼吸道感染的致病菌病原譜也不斷變化，增加了臨床診斷及治療的難度［1］。傳統的培養(yǎng)法是下呼吸道感染病原體檢測的金標準，但由于整個培養(yǎng)過程較為復雜，因此耗時較長，不利于臨床早期治療，容易延誤患者的病情［2］。目前，直接免疫熒光法和間接免疫熒光法在下呼吸道感染病原體中的檢測也發(fā)揮出了較好的應用效果，但診斷的靈敏度和特異度仍相對較低［3］。隨著現代分子生物學技術的快速發(fā)展，病原體分子檢測技術在臨床中的診斷研究也逐漸增多，尤其是基于分子遺傳水平的核酸檢測技術，已經成為了病原體檢測技術中的主流。多重PCR 是在傳統PCR 基礎上發(fā)展的一種檢測方法，可以同時實現多種病原體的同時檢測，近年來在下呼吸道感染的病原體檢測中發(fā)揮出了較好的應用價值［4］。基于此，本研究將提取患者的痰液標本后分別使用多重PCR 和直接免疫熒光法進行病原體檢測，對比不同檢查方式的檢查結果，期望以此來為下呼吸道感染的早期診斷提供依據，現將報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2019年1月至2019年12月于2家醫(yī)院重癥醫(yī)學科接受治療的128例下呼吸道感染患者作為研究對象，男73 例，女55 例，平均年齡（45.69±15.26）歲。其中包括社區(qū)獲得性肺炎44例、慢性支氣管炎急性加重31 例、院內獲得性肺炎29 例、肺心病14 例、慢性阻塞性肺疾病10 例，排除活動性肺結核、吸入性肺炎、阻塞性肺炎或發(fā)病前2周接受過住院治療的患者。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理

針對所有患者進行痰液標本培養(yǎng)，于患者入院后24 h 內使用吸痰管經由患者的鼻孔插入鼻咽部，連接黏液收集器后采集患者的痰液標本，標本提取后使用漩渦混合器將其打散，使用離心儀離心10 min，轉速設定為1 500 r/min，將沉淀物使用pH 值為7.2 的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）10 mL 進行洗滌，共計洗滌2 次，隨后使用1 mL 的PBS 緩沖液將其調成懸液，使用法國生物梅里埃公司的全自動核酸提取儀器（easyMAG）對標本進行自動核酸提取，并放置于PCR 管中保存。所有痰液標本均送檢進行微生物病原學診斷。

1.2.2 免疫熒光法

將標本離心沉淀后制片，放置于常溫條件下自然干燥，使用冷丙酮固定10 min 后取出，待冷丙酮完全揮發(fā)，采用熒光標記的呼吸道病毒單克隆抗體檢測標本的病原體，檢測試劑盒購進于美國Chemicon 公司，具體操作步驟按照試劑盒說明要求進行操作，以2 個及以上完整細胞內有明亮黃綠色熒光判定為陽性。

1.2.3 多重PCR 檢測

根據美國國立生物技術信息中心（NCBI）公布的病原體目的序列找到各病原體的相對保守區(qū)域，并對引物進行設計，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

同時于中國食品藥品檢定研究院購買個病原體的對應參考品，通過對參考品的梯度稀釋使用各引物進行檢測，針對無法有效擴增的病原體濃度即為該位點的擴增靈敏度。對其他的呼吸道病原進行收集和檢測，確保本研究內所使用的的引物并不會對病原核酸產生擴增作用，確定特異度，并將所有檢測靶點的正向和反向引物混合為反轉錄引物混合液和PCR 引物混合液。PCR 擴增后使用遺傳分析儀對樣品的PCR 產物進行毛細電泳片段分離，分析各樣品的峰形圖，所有病原體的PCR 產物片段長度與參考大小之間的差距不得超過1.5 bp，陰性質控品和陽性質控品的峰形圖。見圖1～2。

圖1 陰性質控品峰形圖Figure 1 Peak shape of quality control products

圖2 陽性質控品峰形圖Figure 2 Peak shape of positive quality control products

1.3 統計學處理

使用SPSS 22.0 統計軟件對數據進行處理，計數資料用n（%）表示，用χ2檢驗，計量資料用（±s）表示，用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 下呼吸道感染患者的多重PCR 檢測結果

通過對128 例患者的多重PCR 檢測結果分析，發(fā)現病原體陽性92 份（71.88%），其中有12份標本檢測到兩種或兩種以上病原體，占比9.38%，以FluA 病原體的陽性率最高為39.84%，其次依次為PIV1、PIV2、ADV、RSV 和FluB 等。見表2。

2.2 下呼吸道感染患者的直接免疫熒光法檢測結果

128 例患者檢測結果發(fā)現共有56 份（43.75%）標本為病原體陽性，其中有5 份（3.91%）標本檢測到兩種或兩種以上病原體，其中以FluA 病原體的陽性率最高為25%，其次依次為PIV1、PIV2、RSV、ADV 和FluB 等。見表3。

2.3 多重PCR 與直接免疫熒光法的檢測價值對比

多重PCR 檢測的總靈敏度和準確率明顯高于直接免疫熒光法檢測的總靈敏度和準確率，差異有統計學意義（P＜0.05），特異度相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表2 下呼吸道感染患者的多重PCR 檢測結果［n（%）］Table 2 Multiplex PCR test results of patients with lower respiratory tract infection［n（%）］

表3 下呼吸道感染患者的直接免疫熒光法檢測結果［n（%）］Table 3 Direct immunofluorescence test results of patients with lower respiratory tract infection［n（%）］

表4 多重PCR 與直接免疫熒光法的檢測價值對比（%）Table 4 Comparison of detection value between multiplex PCR and direct immunofluorescence（%）

3 討論

急性呼吸道感染作為全球面臨的嚴重公共衛(wèi)生問題之一，感染的病原體具有多樣性，其中有70%是由病毒所引發(fā)［5］。下呼吸道感染作為呼吸道感染中的常見類型，相關臨床研究中發(fā)現，下呼吸道感染的病原體分布較為廣泛，發(fā)達國家以病毒感染為主，而發(fā)展中國家以細菌感染為主［6］。有報道指出，下呼吸道感染病原體的構成較為復雜，且患者的臨床癥狀缺乏特異性，傳統的病原學診斷主要是通過對病原體的分離培養(yǎng)進行診斷，但該方法花費的時間較長，且鑒定數量有限，因此已經無法滿足臨床診斷的需求［7］。隨著臨床診斷技術的不斷發(fā)展，免疫熒光法在臨床中的應用也日益廣泛，并在病毒和衣原體抗原的檢測中發(fā)揮出了較好的應用效果，具有較高的特異度，但靈敏度卻相對較低。20世紀80年代，PCR 技術被廣泛應用于分子診斷領域，并從最初的傳統PCR 逐漸發(fā)展至多重PCR、反轉錄PCR 和實時定量PCR 等，而檢測的擴增能力和準確性均有所提升，而其中的多重PCR 技術在呼吸道病毒感染患者的病原體篩查中發(fā)揮出了積極的作用［8］。張海鄰等［9］在研究中發(fā)現，PCR 技術的檢出率為58.37%，明顯高于直接免疫熒光法檢測的41.53%，說明PCR 技術在下呼吸道感染的病原體檢測中發(fā)揮出了較好的應用效果。

本研究結果說明與傳統的直接免疫檢測方法相比，多重PCR 可以有效提高臨床診斷的靈敏度和準確率，具有較好的診斷價值。劉馨玉等［10］在研究發(fā)現多重PCR 診斷的敏感度和特異度分別為94.74%和84.38%，均明顯高于間接免疫熒光法，與本文的研究結果一致。鄭凱文等［11］在研究中使用多重PCR 對下呼吸道感染的病原體進行了檢測，結果發(fā)現多重PCR 檢測共計檢出13 種病原體，傳統培養(yǎng)法僅檢出8 種，且多重PCR 檢測的陽性率為79.41%，靈敏度為100%，檢測時間比傳統培養(yǎng)法縮短了至少1 d，進一步證實了多重PCR 可以有效實現對下呼吸道感染病原體的檢測，與本文的研究結果相似。

綜上所述，相較于傳統的直接熒光免疫法檢測，多重PCR 病原體分子檢測在下呼吸道感染中發(fā)揮出了較好的診斷價值，具有較高的靈敏度和特異度，應當在臨床中廣泛應用及推廣。