熊 敏，楊 鑫，吳蘭云

(貴州省黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 黔東南州 556000)

本品為毛茛科植物毛茛RanunculusjaponicusThunb.或揚子毛茛RanunculussieboldiiMiq.的新鮮或干燥全草。夏、秋二季采集，鮮用或洗凈沸水燙過，切段曬干。本品亦為我省少數(shù)民族用藥。最早記載于《本草拾遺》，毛茛為貴州省少數(shù)民族用藥，收載在《貴州草藥》 (第一集)1970年7月第1版，書中描述毛茛為毛茛科毛茛RanunculusjaponicusThunb.的全草。民間苗醫(yī)用藥中習(xí)以新鮮全草或干燥全草入藥，口口相傳，廣為使用。毛茛科Ranunculaceae植物多為草本[1]，由多種化學(xué)藥物組成，在我國有30屬約220種植物可供藥用，全草為外用發(fā)泡藥，治瘧疾、黃疸?。货r根搗爛敷患處可治淋巴結(jié)核；也可作土農(nóng)藥。全草含毛茛苷，鮮根含原白頭翁素(Protoanemonin，C5H4O2)0.12%，在干燥過程中，易發(fā)生分子重合反應(yīng)而變成無刺激性的結(jié)晶白頭翁素(anemonin，C10H8O4)[2]，為有毒植物。全草含原白頭翁素(Protoanemonin，C5H4O2)及其二聚物白頭翁素(anemonin)，新鮮植物含白頭翁素0.05%。

毛莨(《本草拾遺》)[3][異名]水茛、毛建(《肘后方》)，毛建草、猴蒜(《本草拾遺》)，天灸(《夢溪筆談》)，毛董、自灸(《綱目》)，鶴膝草、瞌睡草、老虎草、犬腳跡、老虎腳跡草、火筒青(《中國藥植志》)，野芹菜(《福建民間草藥》)，辣子草、辣辣草(《民間常草藥匯編》)，毛芹菜、老虎須(《江西民間草藥》)，千里光、老鼠腳底板、爛肺草(《中藥植物圖鑒》)，三腳虎、水芹菜(《泉州本草》)，撲地棕、翳子藥、一包針(《貴中草藥》)，魚疔草、鴨腳板、野芹菜、山辣椒、老虎腳爪草、毛芹菜、起泡草(《全國中草藥匯編》)?！度珖胁菟巺R編》[4]中對揚子毛茛的別名有：辣子草、水辣菜。東北至華南以及長江中下游各省，全國大部分地區(qū)均有分布，我省各地均產(chǎn)。毛茛作為地方民間用藥研究甚少，尤其對于其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，缺少相關(guān)科學(xué)文獻。

1 儀器

儀器：1)卡瑪LINOMATAT5半自動點樣器；2)KQ - 500DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

薄層板：1)青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號20160208)；2)青島勝海精細化工硅膠有限公司G板(批號：20171212)；3)青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號：20170811)；4)默克化工技術(shù)(上海)有限公司硅膠G板(批號HC41642055)。

試劑：環(huán)己烷、乙酸乙酯均為分析純。

藥材：所有實驗樣品均由本中心課題組采樣組的人采集，同批壓制標(biāo)本經(jīng)孫慶文教授鑒定，鑒定為毛茛科植物毛茛：RanunculusjaponicusThunb.或揚子毛茛RanunculussieboldiiMiq.。鑒定結(jié)果及樣品來源見表1。

表1 供試樣品來源表Tab.1 Sources of test samples

2 方法與討論

2.1 供試品溶液的制備

分別取毛茛和揚子毛茛1 g，分別加入提取溶劑25 mL，分別超聲處理30 min后，濾過，濾液蒸干，殘渣加相應(yīng)的提取溶劑1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2 對照藥材溶液的制備

原標(biāo)準(zhǔn)無薄層鑒別項，根據(jù)文獻調(diào)研毛茛和揚子毛茛所含成分主要是原白頭翁素，而原白頭翁素?zé)岱€(wěn)定性較差，易轉(zhuǎn)變?yōu)榘最^翁素，而原白頭翁素和白頭翁素市場無對照品可售，故采用自身對照藥材為對照。

2.3 薄層層析

按照2015版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法進行試驗，稱取三棵樹毛茛2份各1 g，分別超聲30 min和回流1 h，稱取青巖揚子毛茛2份各1 g，分別超聲30 min和回流1 h，以95%乙醇為提取溶劑。濾過，濾液蒸干，殘渣分別加95%乙醇各1 mL使溶解，分別取5 μL點于同一硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號20160208))上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，分別置自然光(日光)、碘蒸氣熏10 min和紫外光(365 nm)等條件下檢視。結(jié)果自然光下斑點不太清晰(見圖1)，不建議在日光下觀察斑點；碘蒸氣熏所有斑點較為清晰(見圖2)，可用碘蒸氣熏至斑點清晰后檢視；紫外光(365 nm)下斑點清晰(見圖3)，紫外光(365 nm)下和碘蒸氣熏比較，碘蒸氣有一定的毒性，且在紫外光(365 nm)下檢視更為清晰，建議使用紫外光(365 nm)下檢視。

圖1 日光燈下檢視 圖2 熏蒸后檢視 Fig.1 View under Fig.2 View after fumigation fluorescent lamp

圖3 紫外燈下檢視Fig.3 View under ultraviolet lamp

2.4 毛茛和揚子毛茛的不同提取溶劑考察

按照2015版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法進行試驗，分別稱取毛茛和揚子毛茛1 g，分別以不同濃度甲醇和乙醇為提取溶劑，超聲處理30 min。濾過，濾液蒸干，殘渣分別加甲醇、乙醇各1 mL使溶解，分別取5 μL作為供試品溶液。吸取上述供試品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號20160208))上，以環(huán)己烷∶乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光(365 nm)下檢視。結(jié)果提取溶劑A：用甲醇與95%乙醇，提取斑點顏色無明顯差異，因為乙醇比甲醇較經(jīng)濟，無毒性，故建議用乙醇作為提取溶劑，見圖4；提取溶劑B：用25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取毛茛。結(jié)果25%乙醇、50%乙醇提取出來的斑點均不清晰，而75%乙醇與95%乙醇斑點均清晰，建議用95%乙醇提取方便，不用配制，直接取用，較為省時和簡便，見圖5；提取溶劑B：用25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取揚子毛茛，結(jié)果25%乙醇與50%乙醇的斑點不清晰，而75%乙醇與95%乙醇斑點均清晰，建議用95%乙醇提取方便，不用配制，見圖6。故建議優(yōu)選乙醇為提取溶劑。

圖4 提取溶劑A (1、3揚子毛茛和2、4毛茛)Fig.4 Extraction solvent A (1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

圖5 提取溶劑B(毛茛) 圖6 提取溶劑B(揚子毛茛) Fig.5 Extraction solvent B Fig.6 Extraction solvent B(Ranunculus japonicus) (Ranunculus sieboldii)

2.5 毛茛和揚子毛茛不同溫濕度的考察

按照 2015版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法進行試驗，分別稱取毛茛和揚子毛茛各1 g，用95%乙醇提取，超聲30 min后，濾過，濾液蒸干，殘渣分別加乙醇各1 mL使溶解，吸取上述供試品溶液各5 μL，點于同一硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號20160208))上，使用展開劑(環(huán)己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展開，置于紫外光(365 nm)下檢視薄層色譜圖。結(jié)果溫濕度a：低溫7 ℃與較高濕70%條件下，供試品分離度較好，見圖7；溫濕度b：低溫15 ℃與較高濕85%條件下，供試品分離度較好，見圖8；溫濕度c：中溫20 ℃與較高濕58%條件下，供試品分離度較好，見圖9；溫濕度d：較高溫30 ℃與較高濕72%條件下，供試品分離度較好，見圖10；溫濕度e：較高溫35 ℃與較低濕35%條件下，供試品分離度較好，見圖11。

圖7 溫濕度a(1、3揚子毛茛和2、4毛茛)Fig.7 Temperature and humidity a(1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

圖8 溫濕度b(1、3揚子毛茛和2、4毛茛)Fig.8 Temperature and humidity b(1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

圖9 溫濕度c(1、2毛茛和3、4揚子毛茛)Fig.9 Temperature and humidity c(1，2：Ranunculus japonicus；3，4：Ranunculus sieboldii)

圖10 溫濕度d(1、2毛茛和3、4揚子毛茛)Fig.10 Temperature and humidity d(1，2：Ranunculus japonicus；3，4：Ranunculus sieboldii)

圖11 溫濕度e (1、3揚子毛茛和2、4毛茛) Fig.11 Temperature and humidity e(1，3：Ranunculus sieboldii；2，4：Ranunculus japonicus)

2.6 毛茛與揚子毛茛不同產(chǎn)地和不同薄層板生產(chǎn)廠家考察

圖12 青島勝海Fig.12 Qingdao Shenghai

按照2015版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法進行試驗，分別稱取毛茛和揚子毛茛各1 g，樣品來源分別為：1毛茛(余慶縣城關(guān)20180426)、2毛茛(施秉縣城關(guān)20180427)、3毛茛(凱里三棵樹20180516)、4毛茛(對照藥材)、5揚子毛茛(貴陽市青巖鎮(zhèn)20170505)、6揚子毛茛(荔波縣佳榮鎮(zhèn))、7揚子毛茛(開發(fā)區(qū)甕義20170518)、8揚子毛茛(對照藥材)，在溫度16 ℃，濕度80%條件下，用95%乙醇提取，超聲30 min后，濾過，濾液蒸干，殘渣分別加95%乙醇各1 mL使溶解，吸取上述供試品溶液各5 μL，分別點于3個不同生產(chǎn)廠家薄層板上，使用展開劑(環(huán)己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展開，置于紫外光(365 nm)下檢視薄層色譜圖，結(jié)果點于硅薄層板(青島勝海精細化工硅膠有限公司G板，批號：20171212)上的斑點清晰，見圖12；點于青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號：20170811)上的斑點清晰，見圖13；點于默克化工技術(shù)(上海)有限公司硅膠G板(批號HC41642055)上的斑點清晰，見圖14。

圖13 青島海洋 圖14 默克化工Fig.13 Qingdao Ocean Fig.14 Merck Chemical

2.7 穩(wěn)定性實驗

按照 2015版《中國藥典》四部通則0502薄層色譜法進行試驗，分別稱取毛茛和揚子毛茛各1 g，樣品來源：1毛茛(余慶縣城關(guān)20180426)、2毛茛(施秉縣城關(guān)20180427)、3毛茛(凱里三棵樹20180516)、4毛茛(對照藥材)、5空白對照、6揚子毛茛(貴陽市青巖鎮(zhèn)20170505)、7揚子毛茛(荔波縣佳榮鎮(zhèn))、8揚子毛茛(開發(fā)區(qū)甕義20170518)、9揚子毛茛對照藥材，在溫度8 ℃濕度82%條件下；用95%乙醇提取，超聲30 min后，濾過，濾液蒸干，殘渣分別加95%乙醇各1 mL使溶解，分別吸取上述供試品溶液各5 μL點于任意選取兩個廠家硅膠G薄層板上，使用展開劑(環(huán)己烷∶乙酸乙酯)(4∶1)展開，置于紫外光(365 nm)下檢視薄層色譜圖，結(jié)果供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。結(jié)果表明，分離度好，斑點顯色清晰，見圖15、圖16。故建議選擇將此項列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。

圖15 青島勝海 圖16 青島海洋Fig.15 Qingdao Shenghai Fig.16 Qingdao Ocean

3 結(jié)果

1)此次試驗分別置于自然光(日光)、碘蒸氣熏10 min和紫外光(365 nm)等條件下檢視，結(jié)果自然光下斑點不太清晰，不建議在日光下觀察斑點，碘蒸氣熏所有斑點較為清晰，可用碘蒸氣熏至斑點清晰后檢視，紫外光(365 nm)下斑點清晰，紫外光(365

nm)下和碘蒸氣熏比較，碘蒸氣有一定的毒性，且在紫外光(365 nm)下檢視更為清晰，建議使用紫外光(365 nm)下檢視。

2)提取溶劑的考察

提取溶劑分別是：提取溶劑A(甲醇與乙醇)、提取溶劑B(25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇)，兩種提取溶劑對毛茛和揚子毛茛進行考察，結(jié)果提取溶劑A分別提取毛茛和揚子毛茛，斑點顏色均無明顯差異，因為乙醇比甲醇較經(jīng)濟，無毒性，故建議用乙醇作為提取溶劑；用提取溶劑B提取毛茛和揚子毛茛，結(jié)果25%乙醇、50%乙醇提取出來的斑點均不清晰，而75%乙醇與95%乙醇的斑點均清晰，建議用95%乙醇提取方便，不用配制，直接取用，較為省時和簡便，故建議優(yōu)選乙醇為提取溶劑。

3)溫濕度的考察

分別是：溫濕度a：低溫7 ℃與較高濕70%；溫濕度b：低溫15 ℃與較高濕85%；溫濕度c：中溫20 ℃與較高濕58%；溫濕度d：較高溫30 ℃與較高濕72%；溫濕度e：較高溫35 ℃與較低濕35%。5種溫濕度進行考察，結(jié)果供試品分離度都較好。

4)產(chǎn)地和薄層板生產(chǎn)廠家的考察

分別吸取3個不同產(chǎn)地的毛茛和揚子毛茛點于3個不同生產(chǎn)廠家的硅膠G板上(青島勝海精細化工硅膠有限公司G板(批號：20171212)、青島海洋化工廠分廠硅膠G板(批號：20170811)和默克化工技術(shù)(上海)有限公司硅膠G板(批號HC41642055))，結(jié)果斑點都較清晰。

5)穩(wěn)定性實驗考察

分別吸取3個不同產(chǎn)地的毛茛、揚子毛茛、空白對照和自身對照藥材點于任意兩個不同生產(chǎn)廠家的硅膠G板上，結(jié)果供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。結(jié)果表明：該方法色譜斑點清晰，易于檢出，重現(xiàn)性好，可準(zhǔn)確有效地鑒別出中藥材毛茛和揚子毛茛，故建議選擇將此項列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。