周學(xué)智，張 洋，張亞梅，涂梅琳，楊曉剛，莊田畋

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

良性前列腺增生癥(BPH)是一種常見的男性泌尿系統(tǒng)疾病，患者多伴有進(jìn)行性尿頻、尿急、夜尿次數(shù)增多、排尿困難等癥狀，嚴(yán)重者將導(dǎo)致尿潴留、腎結(jié)石、腎積水、腎功能不全等并發(fā)癥。流行病學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)[1]，50歲以上男性是BPH的高發(fā)人群，且80歲以上老年男性患病率高達(dá)95%。隨著人口老齡化逐漸加重，BPH的患病人數(shù)逐年增多，將給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明BPH發(fā)病因素與機(jī)體內(nèi)激素水平異常、炎癥反應(yīng)及前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖密切相關(guān)。臨床常采用抗雄激素藥物及手術(shù)切除方法改善患者癥狀，但易引起頭暈、頭痛、乏力、困倦、體位性低血壓、異常射精等不良反應(yīng)的發(fā)生率[3]。中醫(yī)藥在治療BPH方面發(fā)揮獨(dú)特的優(yōu)勢，能夠明顯縮小前列腺體積，還可降低患者并發(fā)癥的發(fā)生率、提高患者生活質(zhì)量[4]。

淫羊藿( Epimedii Folium)是小蘗堿科草本植物，又稱仙靈脾，其主要化學(xué)成分為木脂素類、黃酮類、酚苷類、生物堿類等?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》首次記載淫羊藿并將其列為中品，并提出其具有主陰痿絕傷、莖中痛、利小便的作用。淫羊藿是常用的補(bǔ)腎陽中藥，古代醫(yī)家常將其用于男科疾病的治療。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿及其主要化學(xué)成分具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)性激素水平和調(diào)控自噬等作用，并在BPH的治療過程中發(fā)揮積極作用[5]，徐薇等提出淫羊藿的主要化學(xué)成分對小鼠睪丸組織具有較好的保護(hù)作用，還可提升腎陽虛患者體內(nèi)睪酮的含量[6]。涂梅琳等發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能夠通過抑制自噬過程來減輕BPH模型大鼠的前列腺體積和濕重等增生狀況[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)方法進(jìn)行藥理學(xué)研究的新興學(xué)科，基于“疾病-靶點(diǎn)-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)綜合地觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，強(qiáng)調(diào)對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費(fèi)用。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究淫羊藿治療BPH的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

本研究借助的數(shù)據(jù)庫和軟件包括TCMSP數(shù)據(jù)(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)、Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https：//www.disgenet.org/)、String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)、DAVID 數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)、Cytoscape 3.6.0軟件、R軟件和perl軟件。

1.2 化合物篩選及靶點(diǎn)收集

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以“淫羊藿”為關(guān)鍵詞檢索化合物，依據(jù)口服生物利用度( oral bioavailablity，OB)>30%和類藥性(drug likeness，DL)>0.18的原則篩選有效化學(xué)成分及其靶點(diǎn)。有效化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫比對后確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)化名稱[8]。

1.3 良性前列腺增生癥的靶點(diǎn)預(yù)測

使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“Benign prostatic hyperplasia”，獲取良性前列腺增生癥的相關(guān)作用靶點(diǎn)[9]。借助R語言制作淫羊藿和BPH的靶點(diǎn)Venn圖，并通過Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建淫羊藿有效化學(xué)成分-BPH-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建

在String數(shù)據(jù)庫中輸入交集靶點(diǎn)，并設(shè)定物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建淫羊藿治療BPH的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)( protein-protein interaction，PPI)[10]。借助Cytoscape 3.6.0軟件的“Network Analysis”獲取網(wǎng)絡(luò)度值(degree)，以確定關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 生物學(xué)功能和通路分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，并設(shè)定物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析[11]。最后，通過R語言繪制GO功能和KEGG通路氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿化合物篩選及靶點(diǎn)收集結(jié)果

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫尋找淫羊藿的有效化學(xué)成分，共收集到130個(gè)化學(xué)成分，依據(jù)OB>30%，DL>0.18的標(biāo)準(zhǔn)，獲得22個(gè)有效化學(xué)成分和106個(gè)靶點(diǎn)。淫羊藿有效化學(xué)成分基本信息見表1。由Cytoscape 3.6.0軟件制作淫羊藿有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。其中涉及232條邊和126個(gè)節(jié)點(diǎn)，圓形表示靶點(diǎn)，菱形為活性化合物。

表1 淫羊藿有效化學(xué)成分基本信息表Tab.1 Basic information of effective chemical components of Epimedii Folium

圖1 淫羊藿有效化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Epimedii Folium effective chemical components-targets network

2.2 良性前列腺增生癥的靶點(diǎn)預(yù)測

根據(jù)關(guān)鍵詞，在DisGeNET數(shù)據(jù)庫中獲取BPH相關(guān)靶點(diǎn)770個(gè)，并將其與淫羊藿有效化學(xué)成分對應(yīng)靶點(diǎn)取交集后得到44個(gè)靶點(diǎn)，如圖2所示。由Cytoscape 3.6.0 軟件制作淫羊藿有效化學(xué)成分-BPH-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。其中涉及141條邊和60個(gè)節(jié)點(diǎn)，44個(gè)圓形表示靶點(diǎn)，15個(gè)菱形為活性化合物，1個(gè)四邊形為BPH。利用Network Analysis功能對網(wǎng)絡(luò)分析degree值前3名的化合物為quercetin(槲皮素)、kaempferol(山柰酚)、luteolin(木犀草素)，見表2。

圖2 淫羊藿有效化學(xué)成分治療BPH的相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Wayne map of the targets of effective chemical components of Epimedii Folium in the treatment of BPH

圖3 淫羊藿有效化學(xué)成分-BPH-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Epimedii Folium effective chemical components-BPH-targets network

表2 核心化學(xué)成分degree值Tab.2 Degree values of core chemical components

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建結(jié)果

采用String數(shù)據(jù)庫對篩選出的交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，將PPI中得分大于0.4的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入Cytoscape3.6.0軟件進(jìn)行Network Analysis功能分析，繪制出交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的形狀越大表示degree值越高，該節(jié)點(diǎn)的作用越強(qiáng)，其中degree值前3名的靶點(diǎn)為TP53、ESR1、IL6，見表3。

圖4 淫羊藿治療BPH靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network of Epimedii Folium in the treatment of BPH

表3 核心靶點(diǎn)degree值Tab.3 Degree values of core targets

2.4 生物學(xué)功能和通路分析結(jié)果

44個(gè)交集靶點(diǎn)富集了1173個(gè)生物學(xué)過程(P<0.05)，選取P值排名前20的功能信息，如圖5A、5B、5C。富集結(jié)果顯示交集靶點(diǎn)主要富集在雌激素反應(yīng)(response to estradiol)、腺體發(fā)育(gland development)、蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)等過程。KEGG分析結(jié)果共有39條KEGG通路參與其中，如圖5D所示，主要涉及HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT信號通路(Jak-STAT signaling pathway)、VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、 ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)等。

圖5 淫羊藿治療BPH的GO富集和KEGG通路氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of GO enrichment and KEGG pathway of Epimedii Folium in the treatment of BPH

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為BPH屬“癃閉”等范疇，其病機(jī)主要為腎氣不足、瘀血阻絡(luò)?！吨T病源候論》指出腎氣不足，封藏失職，導(dǎo)致小便頻數(shù)而清長或淋漓不盡；腎藏一身陽氣，腎陽不足，則無力蒸化水液，致使膀胱開闔不利進(jìn)而發(fā)展為尿閉。淫羊藿具有扶陽固本，補(bǔ)腎填精之功效。目前，臨床上常用淫羊藿治療男性泌尿系統(tǒng)疾病，尤其可緩解BPH患者尿頻、夜尿次數(shù)增多和排尿困難等癥狀。但其具體作用機(jī)制尚不明確，因此本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討淫羊藿治療BPH的作用機(jī)制。對“淫羊藿有效化學(xué)成分-BPH-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析，degree值排序前3名的有效化學(xué)成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素，故推測這可能是淫羊藿治療BPH的關(guān)鍵有效成分。槲皮素是黃酮類化合物的主要代表，具有抗癌、抗炎、抗糖尿病和抗微生物活性等多種作用，并可延緩BPH的發(fā)展進(jìn)程。睪丸激素和致癌物(MNU)誘導(dǎo)的BPH大鼠經(jīng)槲皮素治療后可顯著降低睪丸腹側(cè)和背外側(cè)區(qū)域的發(fā)病率[12]。山奈酚又名百蕊草素Ⅲ，屬于黃酮類化合物，廣泛存在于各種水果、蔬菜及飲料中，在治療和緩解BPH的癥狀過程中發(fā)揮重要作用[12]。此外，山奈酚能夠通過抑制前列腺癌細(xì)胞的雄激素信號通路(如：AR、PSA、TMPRSS2和TMEPA1)的表達(dá)進(jìn)而加速其凋亡的進(jìn)程[13]。木犀草素存在于大量植物中，對腫瘤、過敏性疾病和生殖系統(tǒng)疾病具有較好的治療作用。在BPH的治療過程中，木犀草素可以通過抑制AR、ERα表達(dá)，降低血清中雌二醇(E2)、二氫睪丸酮(DHT)的水平進(jìn)而達(dá)到治療BPH的目的[14]。因此，槲皮素、山奈酚、木犀草素3個(gè)化學(xué)成分可能在淫羊藿治療BPH中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

采用String數(shù)據(jù)庫對篩選出的交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，其中degree前3名的靶點(diǎn)為TP53、ESR1、IL6。TP53又稱p53基因，是一個(gè)高突變性基因，對前列腺功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。BPH患者體內(nèi)呈現(xiàn)大量p53基因的突變會(huì)增加前列腺癌的產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)[15]。ESR1也稱為雌激素受體α(ESRα)，是雌激素受體的兩種亞型之一，與前列腺增生存在密切關(guān)聯(lián)性。ESRα具有一定的多態(tài)性，其中Xbal和PvuII是2個(gè)最常見的多態(tài)性位點(diǎn)，可使BPH患者的前列腺組織發(fā)生增生性改變，增加癌變的風(fēng)險(xiǎn)[13]。IL6是一種多效性細(xì)胞因子，能夠通過類固醇生成酶的活化來誘導(dǎo)前列腺內(nèi)睪丸激素產(chǎn)生，還可刺激前列腺癌細(xì)胞的增殖和引起前列腺組織損傷[16]。因此，TP53、ESR1、IL6可作為BPH潛在的治療靶點(diǎn)。

GO富集和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)交集靶點(diǎn)主要富集在雌激素反應(yīng)、腺體發(fā)育、蛋白激酶結(jié)合等過程和HIF-1、p53、PI3K-Akt、JAK-STAT、VEGF、ErbB等信號通路。睪丸分泌的雄激素具有促進(jìn)腺體發(fā)育的作用，且前列腺的腺體發(fā)育情況在BPH臨床診療中占有重要地位[17]。蛋白激酶是一類主要的細(xì)胞內(nèi)信號分子，可延緩BPH的發(fā)展進(jìn)程[18]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。值得注意的是，HIF-1α 在高度增生的前列腺組織中表達(dá)增加，并與前列腺重量密切相關(guān)，可作為BPH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[19]。BPH與前列腺上皮細(xì)胞衰老存在高度關(guān)聯(lián)性，p53信號通路可促進(jìn)細(xì)胞衰老、凋亡和周期停滯等一系列細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控睪丸生殖細(xì)胞的DNA損傷[20]。PI3K-AkT通路的過表達(dá)可促使前列腺增大，給予BPH模型大鼠PI3K/AKT抑制劑治療后可顯著降低前列腺濕重和前列腺指數(shù)[21]。據(jù)報(bào)道JAK-STAT和VEGF是IL6的主要下游信號通路[22]，將VEGF通路抑制劑給予BPH模型大鼠治療后可顯著減少前列腺重量、大小及前列腺組織的厚度[23]，調(diào)控JAK/STAT1信號通路可延緩前列腺細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[24]。雌激素在BPH的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，其主要包括ERα和ERβ兩種受體形式，ERα主要存在于前列腺基質(zhì)細(xì)胞，ERβ主要表達(dá)于前列腺上皮[25]，且原代前列腺基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)雌激素干預(yù)后對炎癥因子的表達(dá)產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用[26]。因此，雌激素反應(yīng)、腺體發(fā)育、蛋白激酶結(jié)合等過程和HIF-1、p53、PI3K-Akt、JAK-STAT、VEGF、ErbB等信號通路可作為淫羊藿治療BPH的潛在機(jī)制。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測淫羊藿治療BPH的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)淫羊藿治療BPH有效成分及作用機(jī)制呈現(xiàn)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特性。研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿中的槲皮素、山柰酚和木犀草素等化學(xué)成分，TP53、ESR1和IL6等核心靶點(diǎn)，雌激素反應(yīng)、腺體發(fā)育、蛋白激酶結(jié)合等過程和HIF-1、p53、PI3K-Akt、JAK-STAT、VEGF、ErbB等信號通路是淫羊藿治療BPH的潛在作用機(jī)制。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法僅對藥物治療疾病進(jìn)行預(yù)測，存在一定的局限性，后續(xù)課題組仍需借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證淫羊藿治療BPH的具體作用機(jī)制。