黑 偉，何志強(qiáng)，張燕偉，張萬鋒，蔡春波，楊 陽，高鵬飛，郭曉紅，曹果清，李步高

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801)

2002 年，纖連蛋白Ⅲ型重復(fù)含蛋白(Fibronectin type Ⅲ Repeat Containing Protein，F(xiàn)RCP2) 被發(fā)現(xiàn)，它包含信號肽、纖維蛋白結(jié)構(gòu)域和疏水性C 末端結(jié)構(gòu)域，可以水解形成具有分泌功能的蛋白質(zhì)鳶尾素(Irisin)[1-2]。在小鼠上，抗纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5(Fibronectin Type III Domain Containing Protein5，F(xiàn)NDC5) 基因定位在四號染色體上，包含6 個外顯子，翻譯209 個氨基酸殘基，信號肽為第1 個至第30 個氨基酸殘基，纖維蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?1 個至第114 個氨基酸殘基，疏水性C 末端結(jié)構(gòu)域?yàn)榈?15 個至第172 個氨基酸殘基。Irisin 包含112 個氨基酸殘基，分子量約為12 kDa。生物化學(xué)和X 射線晶體學(xué)研究都表明，Irisin 以同二聚體的形式存在，在同二聚體之間形成β-折疊。這種結(jié)構(gòu)通過氫鍵與相鄰亞單位(特別是Arg-75 和Glu-79) 之間相互作用，保護(hù)二聚體末端[3]。

Varela 等報道，F(xiàn)NDC5 在骨骼肌中高表達(dá)，在心血管、脂肪和肝組織中也有少量表達(dá)[4]。Irisin 通過p38 MAPK 和ERK MAPK 通路可促進(jìn)脂肪組織UCP-1、PGC-1α、Cox7α、Ebf3等產(chǎn)熱特異性基因的表達(dá)，引起白色脂肪棕色化，增加機(jī)體能量消耗[5]。FNDC5 可以增加高脂飲食小鼠的能量消耗，從而使小鼠體重減輕，并且能提高胰島素的敏感性[6]。大鼠靜脈注射Irisin，通過AMPK 信號通路可改善自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而降低其血壓[7]。Irisin 通過抑制小鼠CD36、NF-κB 的表達(dá)可減緩動脈粥樣硬化的發(fā)生，還可以使動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)浸潤的巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞以及主動脈炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量降低，進(jìn)而減緩病情發(fā)展[8]。

目前國內(nèi)外關(guān)于FNDC5 基因的研究大多都是針對人和小鼠上的FNDC5 基因，對豬FNDC5 基因的研究報道較少。本研究利用RTPCR 擴(kuò)增豬FNDC5 基因的編碼序列(Coding Sequence，CDS)，運(yùn)用軟件對FNDC5 基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用qRT-PCR 檢測FNDC5基因在晉汾白豬各組織中的表達(dá)量，為以后研究豬FNDC5 基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

選取3 頭1 日齡晉汾白豬，屠宰后取其背最長肌、腎、肝、心、胃、肺、皮下脂肪和脾等組織，迅速放入液氮罐中，之后于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

2×ES Tap MasterMix 購自CWBIO 公司；TRIZOL? Reagent 購 自Life Technologies公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量試劑盒購自TaKaRa 公司；氯仿、異丙醇和乙醇等均為分析純。

1.2 引物設(shè)計和合成

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找豬FNDC5 mRNA 序列，運(yùn)用 Primer Premier 5.0 設(shè)計普通PCR 引物以及qRT-PCR 引物，選取18S rRNA 為內(nèi)參基因，引物由上海生工生物工程公司合成，引物信息見表1。

1.3 總RNA 提取和cDNA 合成

按照Trizol? Reagent 試劑盒說明書提取晉汾白豬各組織的總RNA，測定純度和濃度后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA 合成采用兩步法，20 μL 體系，第1 步：RNA 800 ng，加去除基因組DNA 反應(yīng)試劑至10 μL，混勻后42 ℃反應(yīng)2 min；第2 步：在上述混合液中加入反轉(zhuǎn)錄試劑10 μL，總體系為20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。得到的cDNA 于－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 FNDC5 基因CDS 序列擴(kuò)增

以晉汾白豬背最長肌cDNA 為模板擴(kuò)增豬FNDC5 基因的CDS 序列，PCR 反應(yīng)體系為：2×ES Tap MasterMix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O 6 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)加熱4 min；94 ℃變性30 s；61 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s；共40 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測后進(jìn)行膠回收。將回收純化的產(chǎn)物與pMD18-T 載體于16 ℃下過夜連接。得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂板挑菌，菌液經(jīng)PCR 鑒定后送華大基因公司測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI 網(wǎng)站的ORF Finder 預(yù)測FNDC5基因的開放閱讀框；利用在線軟件 ProtParam對FNDC5 基因的編碼蛋白進(jìn)行理化特性分析；利用ProtScale 軟件分析豬FNDC5 的疏水性圖譜；利用在線軟件PSORT 域預(yù)測FNDC5的亞細(xì)胞定位；運(yùn)用SOPMA 在線軟件對FNDC5 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用SWISSMODEL 軟件分析FNDC5 三級結(jié)構(gòu)。

1.6 晉汾白豬各組織FNDC5 基因的表達(dá)水平分析

以1 日齡晉汾白豬各組織cDNA 為模板，18S rRNA 為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR 檢測FNDC5 基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系如下：上下游引物各0.3 μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ(2×)5 μL，cDNA 1 μL，RNase-free H2O 3.4 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 30 s，60 ℃1 min；95 ℃ 30 s。每個樣本設(shè)3 個重復(fù)，基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0 軟件中的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果采用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 FNDC5 基因CDS 序列擴(kuò)增

以晉汾白豬背最長肌cDNA 為模板克隆FNDC5 基因的CDS 序列，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的目的條帶與預(yù)期條帶大小相符(圖1)。膠回收后與pMD18-T 載體連接，經(jīng)菌液PCR 篩選后送去測序，測序結(jié)果與NCBI 中豬FNDC5 基因CDS 序列完全匹配。

2.2 FNDC5 基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1FNDC5 基因開放閱讀框預(yù)測

運(yùn)用NCBI 中的ORF Finder 程序進(jìn)行分析，F(xiàn)NDC5 基因的開放閱讀框位于1 bp～843 bp，編碼280 個氨基酸(圖2)。

2.2.2 FNDC5 的理化特性分析

利用在線軟件 ProtParam 對FNDC5 基因的編碼蛋白進(jìn)行理化特性分析，結(jié)果表明，F(xiàn)NDC5 的分子式為C1382H2223N385O401S17，總原子數(shù)為4 408 個，分子量為31.19 ku，理論等電點(diǎn)(PI)為8.55。FNDC5 共包含20 種氨基酸，含量最高的為亮氨酸(10.4%)，最少的為組氨酸和酪氨酸，所占比例都為1.4%(表2)。帶正電氨基酸殘基(精氨酸和賴氨酸)33 個，帶負(fù)電氨基酸殘基(天冬氨酸和谷氨酸)29 個。平均親水性系數(shù)是－0.069，不穩(wěn)定系數(shù)為58.43。該蛋白半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為94。

圖2 豬FNDC5 基因開放閱讀框預(yù)測

2.2.3 FNDC5 疏水性分析及亞細(xì)胞定位

利用ProtScale 軟件分析豬FNDC5 的疏水性圖譜(圖3)。FNDC5 第152 位氨基酸的疏水性分值最高，為4.022，疏水性最強(qiáng)，第177 位和第199 位氨基酸的分值最低，為－3.078，親水性最強(qiáng)。FNDC5 共編碼280 個氨基酸，其中145 個氨基酸的分值小于0，135 個氨基酸的分值大于0，親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，但均勻分布在整個肽鏈中。

利用在線軟件PSORT 域預(yù)測FNDC5 的亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，F(xiàn)NDC5 主要位于細(xì)胞質(zhì)中，44.4%位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，33.3%位于高爾基體，22.2%位于細(xì)胞質(zhì)膜。

2.2.4 FNDC5 高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用SOPMA 在線軟件對FNDC5 的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別占31.79%、4.64%、20.36 % 和43.21 % (圖4)。利 用SWISSMODEL 軟件分析FNDC5 的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，F(xiàn)NDC5 含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等復(fù)雜結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖5 豬FNDC5 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.5FDNC5 基因在各組織的表達(dá)特性分析

利用qRT-PCR 檢測FNDC5 基因在晉汾白豬8 種組織(背最長肌、腎、肝、心、胃、肺、皮下脂肪和脾)中的表達(dá)量。由圖6 可知，在所檢測的8 種組織中，F(xiàn)NDC5 基因均有表達(dá)，但存在較大差異。FNDC5 基因在肌肉、肝臟和心臟中高表達(dá)，在其他組織中的表達(dá)量較少。

3 討論

FNDC5 基因在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、能量代謝和血管生成方面有重要作用。目前，F(xiàn)NDC5 基因在人類心血管疾病方面以及在小鼠肌肉與脂肪等組織上的研究較多[9-11]，在豬上的報道較少。本試驗(yàn)運(yùn)用PCR 擴(kuò)增得到晉汾白豬FNDC5 基因的CDS 序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用qRT-PCR 檢測FNDC5 基因在晉汾白豬各組織中的表達(dá)情況。

骨骼肌是能量代謝最旺盛的器官，參與機(jī)體各種生命活動。過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α(Peroxisome Proliferatoractivated Receptor Gamma Coactivator 1α，PGC1α)是一種參與基因表達(dá)調(diào)控的因子，在維持葡萄糖、脂質(zhì)和能量穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。PGC1α 通過運(yùn)動在骨骼肌中被誘導(dǎo)，并具有刺激運(yùn)動的有益作用[12]。Bostrom 等[6]在小鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PGC 1α 水平升高時會上調(diào)Irisin 表達(dá)，在其分泌到血液時會促進(jìn)UCP1的表達(dá)，并誘導(dǎo)白色脂肪細(xì)胞向米色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加機(jī)體總能量的消耗。有報道顯示，耐力訓(xùn)練可提高快肌中Irisin 蛋白水平，降低慢肌中Irisin 蛋白水平[13]。FNDC5 基因在豬上的功能及其調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探討。