■喬君毅 任繼武 樊瑞泉 員世宇

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所，山西太原030000）

豆渣是生產(chǎn)豆腐等豆制品的副產(chǎn)品，營養(yǎng)豐富，富含有利于畜禽生長的膳食纖維、維生素B1、微量元素等，是良好的蛋白飼料來源[1-2]。但是，由于豆渣含水量過高(80%左右)[3]，不易貯存，處理不及時(shí)而酸敗發(fā)臭，容易造成環(huán)境污染。此外，豆渣含有胰蛋白酶抑制素、致甲狀腺腫素、凝血素等抗?fàn)I養(yǎng)因子影響其適口性和動(dòng)物消化，不適合直接作為飼料[4-5]。此外,受人多地少、人增地減的基本國情制約，蛋白飼料短缺已成為制約我國畜牧業(yè)生產(chǎn)的主要問題，迫切需要開發(fā)非糧食類的飼料資源。通過將農(nóng)副廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料是解決蛋白飼料短缺問題的有效途徑，受到我國研究人員的普遍關(guān)注[6]。因此，通過將豆渣微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為發(fā)酵飼料，不但可以改善其適口性，而且對(duì)改善生態(tài)環(huán)境、解決蛋白飼料資源短缺等具有現(xiàn)實(shí)意義。

張文佳等[7]通過白地霉和產(chǎn)朊假絲酵母混合發(fā)酵豆渣，改善了其適口性并提高了貯存性能。張永根等[8]利用乳酸菌和枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵，降低了豆渣pH，提高了其貯存性能。辜瀾濤等[9]利用乳酸菌、酵母菌和枯草桿菌固態(tài)發(fā)酵豆渣，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵前提高了42%。莫重文[10]以米曲霉、黑曲霉和啤酒酵母為菌種，固態(tài)發(fā)酵豆渣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到29.76%，比發(fā)酵前提高了43.07%。

通常影響豆渣發(fā)酵生產(chǎn)菌體蛋白飼料的因素分為培養(yǎng)料的因素和生產(chǎn)工藝的因素，前人主要集中于生產(chǎn)工藝因素的研究，對(duì)培養(yǎng)料因素的研究甚少。因此，本試驗(yàn)選用三種菌株固態(tài)發(fā)酵豆渣，通過研究初始含水量、pH值、氮源以及輔料對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中營養(yǎng)成分的影響，目的在于保留豆渣原有的優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，粗蛋白質(zhì)含量有所提高，改善其在動(dòng)物腸道中的消化率，并且最大程度地提高豆渣的適口性，同時(shí)為豆渣飼料化生產(chǎn)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergill usniger)和產(chǎn)朊假絲酵母(Cadidautilis)由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧微生物實(shí)驗(yàn)室提供，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所提供。

1.2 常規(guī)培養(yǎng)基

黑曲霉保存采用PDA 培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)采用察氏培養(yǎng)基[11]；釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母保存采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，液體種子液培養(yǎng)采用PYG 培養(yǎng)基[11]。

1.3 黑曲霉孢子懸液制備

已培養(yǎng)好的黑曲霉孢子斜面一支，加入10 mL無菌水，洗脫下孢子，制成孢子懸液并用無菌水調(diào)整孢子濃度為3×108CFU/mL備用。

1.4 酵母菌培養(yǎng)液的準(zhǔn)備

酵母菌在PYG 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)達(dá)到生長對(duì)數(shù)期時(shí)，測(cè)定液體培養(yǎng)液中的酵母菌細(xì)胞數(shù)，然后用無菌水稀釋到細(xì)胞濃度為3×108CFU/mL備用。

1.5 接種液的準(zhǔn)備

分別取100 mL 黑曲霉孢子懸液、釀酒酵母培養(yǎng)液以及產(chǎn)朊假絲酵母培養(yǎng)液混合，制成細(xì)胞（孢子）濃度為108CFU/mL的混懸液備用。

1.6 原料及處理

鮮豆渣取初始含水率80%～90%，80 ℃烘干，備用。麩皮購自太谷面粉廠。

1.7 無氮平板培養(yǎng)基

豆渣80 g、麩皮20 g、葡萄糖10 g、KH2PO42 g、硫酸鎂1 g、水1 000 mL、瓊脂20 g，121 ℃、0.1 MPa滅菌30 min。

1.8 混菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方的篩選

1.8.1 培養(yǎng)基不同初始含水量的選擇

按照豆渣∶麩皮=4∶1（干重比，豆渣、麩皮和水分總和為100%），添加KH2PO4、氯化鈉、硫酸鎂、葡萄糖、硫酸銨、尿素，分別占豆渣和麩皮總量的2%、1%、0.5%、2%、0.2%和2%，含水量分為30%、40%、50%、60%、70%和80%共6 個(gè)水平，將發(fā)酵料充分?jǐn)嚢?，混合均勻，?0 g 的瓶裝量裝到罐頭瓶中，然后接種液按10%的接種量（體積/質(zhì)量）接入到發(fā)酵料中，于28～30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)96 h，分析測(cè)定其粗蛋白質(zhì)含量、蛋白酶活力和纖維素酶活力。

1.8.2 pH值的確定

為了確定不同的pH 值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響，本試驗(yàn)使用冰醋酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)固態(tài)發(fā)酵料中的酸堿度，并將其分為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5共6個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)96 h，分析測(cè)定其粗蛋白質(zhì)含量、蛋白酶活力和纖維素酶活力。

1.8.3 氮源的選擇

選擇尿素、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鎂和硝酸鈉為試驗(yàn)氮源。在接種混合菌種組合的無氮平板培養(yǎng)基的不同位置點(diǎn)上不同的氮源，每一個(gè)平板點(diǎn)一種氮源，每一種氮源三個(gè)平板。觀察并測(cè)定生長圈直徑，篩選出生長圈直徑大的氮源，然后將篩選出來的氮源分為幾個(gè)不同的添加水平，通過生長圈測(cè)定進(jìn)一步試驗(yàn)，最后，通過固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)確定不同氮源之間的比例。

1.8.4 輔料的篩選

按照豆渣∶麩皮∶輔料=8∶1∶1（干重比，料和水分總和為100%），在上述確定的含水量、pH值和氮源的基礎(chǔ)上，再添加KH2PO4、NaCl、硫酸鎂和葡萄糖，分別占料的2%、1%、0.5%和2%，選擇肉粉、豆粕、魚粉、酒精粉、棉粕、玉米秸稈、醋糟、玉米粉和麩皮作為9種輔料，將發(fā)酵料充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，培養(yǎng)96 h，分別測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白相對(duì)提高率、纖維素酶活力和蛋白酶活力。

1.8.5 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了四因素、三水平L9（34）正交試驗(yàn)，分別考察了初始含水量（因素A）、pH值（因素B）、含氮量（因素C）和硫酸銨與尿素的比例（N/N，因素D）對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響主次和最優(yōu)組合。發(fā)酵條件為：豆渣∶麩皮∶醋糟=8∶1∶1，接種量10%，接種比例1∶1∶1，瓶裝量40 g，28～30 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，65 ℃干燥，粉碎后測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量。

1.9 分析方法

粗蛋白測(cè)定：采用微量凱氏定氮法（GB/T 14771—1993）[12]；纖維素酶活力的測(cè)定：CMC（羧甲基纖維素）法[13]；蛋白酶活力的測(cè)定：根據(jù)董曉燕[14]方法測(cè)定。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0 進(jìn)行方差分析和多重比較。結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

對(duì)于固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵料的初始含水量是影響微生物生長和繁殖的一個(gè)重要因素，它直接影響到發(fā)酵產(chǎn)物的利用價(jià)值，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同初始含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

圖2 不同初始含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活力和蛋白酶活力的影響

由圖1可知，隨著初始含水量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量逐漸增加，當(dāng)初始水分含量為60%時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到27.61%，然后，隨著初始含水量的增加，粗蛋白質(zhì)含量逐漸減少。初始含水量為50%和60%時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量差異并不顯著（P＞0.05）。

由圖2 可以看出，隨著初始含水量的增加，纖維素酶活力和蛋白酶活力逐漸增加，水分含量達(dá)到50%時(shí)，纖維素酶活力和蛋白酶活力最大，分別為131.75 U/g 和31.55 U/g，水分含量大于50%時(shí)，纖維素酶活力和蛋白酶活力隨著水分含量的增加而下降。

2.2 初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

發(fā)酵料中的初始pH值影響菌種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)速度、細(xì)胞內(nèi)酶的活性生長繁殖以及其蛋白質(zhì)的積累。本試驗(yàn)按照1.8.1的方法，初始含水量50%，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果見圖3和圖4。

從圖3中可以看出，在酸性環(huán)境中發(fā)酵出來的發(fā)酵產(chǎn)物，其粗蛋白質(zhì)含量高于在堿性環(huán)境中發(fā)酵出來的發(fā)酵產(chǎn)物，在pH 值等于5.5 時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高水平，可以達(dá)到27.05%。

圖3 不同pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

圖4 不同pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶和蛋白酶活力的影響

由圖4可知，pH值4.5時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的纖維素酶活力最高，其次是pH 值5.5 時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)物，但二者的差異并不顯著（P＞0.05）；pH 值5.5 時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白酶活力最高，達(dá)到了32.89 U/g。

2.3 無機(jī)氮源的研究

2.3.1 生長圈測(cè)定試驗(yàn)

在接種有混合菌種的無氮平板培養(yǎng)基上，在不同位置點(diǎn)上用不同的氮源進(jìn)行培養(yǎng)，觀察并測(cè)定菌種的生長圈直徑，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 不同氮源對(duì)生長圈直徑的影響（mm）

表1結(jié)果表明，混菌種同化硝酸鈉和硝酸鎂的能力很小，但能很好地利用尿素、硫酸銨，且硫酸銨對(duì)混菌種的作用效果最好，尿素次之。

2.3.2 不同濃度的尿素、硫酸銨的比較試驗(yàn)

為驗(yàn)證對(duì)混合菌種有作用的兩種氮源（尿素和硫酸銨）的濃度對(duì)混合菌種生長效果的影響，進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2 測(cè)定結(jié)果可以看出，對(duì)于每一種氮源，隨著添加量的增加，菌種在無氮平板培養(yǎng)基上的生長圈直徑逐漸增大，說明增加各種氮源濃度有利于混合菌種的生長繁殖。但當(dāng)尿素濃度增加到3.21%、硫酸銨濃度增加到7.70%以上時(shí)，約相當(dāng)含氮量1.5%時(shí)，其生長圈直徑增大不再明顯。

從表1和表2結(jié)果可知，本試驗(yàn)的菌種組合適宜的環(huán)境是酸性環(huán)境，硫酸銨雖然是生理酸性物質(zhì)，但價(jià)格比較高，沒有尿素經(jīng)濟(jì)，同時(shí)硫酸銨含氮量低，過量使用會(huì)使硫酸根離子過多，不利于發(fā)酵。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，選擇尿素和硫酸銨作為底物發(fā)酵添加的無機(jī)氮源。

表2 不同濃度的氮源生長圈直徑測(cè)定結(jié)果

2.3.3 硫酸銨、尿素比例（N/N）的確定

由于尿素是生理堿性物質(zhì)，它和硫酸銨之間的比例決定了發(fā)酵料的pH值，影響菌種的生長。因此，按照初始含水量50%，pH值5.5，含氮量1.5%，硫酸銨和尿素比例（N/N）為：1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1五個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 不同氮源比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量的影響

圖6 不同氮源比例對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物纖維素酶活力和蛋白酶活力的影響

由圖5 可知，當(dāng)硫酸銨和尿素之間的比例（N/N）為2∶1 時(shí)，發(fā)酵物中的粗蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到31.84%，當(dāng)硫酸銨添加量增加時(shí)，粗蛋白含量降低，并且差異顯著（P＜0.05）。

由圖6 可以看出，隨著硫酸銨比例的提高，發(fā)酵產(chǎn)物中的纖維素酶活力和蛋白酶活力逐漸增大。當(dāng)比例為2∶1時(shí)，纖維素酶活力最高，但與比例為3∶1時(shí)的纖維素酶活力差異并不顯著（P＞0.05）；比例為3∶1時(shí)，蛋白酶活力最大，但與比例為2∶1時(shí)蛋白酶活力相比，差異并不顯著（P＞0.05）。

2.4 輔料的選擇

按照初始含水量50%，pH值5.5，含氮量1.5%，硫酸銨與尿素（N/N）之間的比例為2∶1進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3 可知，在發(fā)酵底物中使用不同的輔料，對(duì)粗蛋白質(zhì)含量相對(duì)提高率、纖維素酶活力和蛋白酶活力都有不同程度的影響。從粗蛋白質(zhì)含量相對(duì)提高率上看，大小順序依次為：玉米粉、玉米秸稈、醋糟、麩皮、酒精粉、棉粕、豆粕、肉粉和魚粉，但是前三者的差異并不顯著（P＞0.05）。從纖維素酶活力上看，差異比較明顯，其中最高的是玉米秸稈，其次為醋糟，他們都具有粗纖維含量相對(duì)較高、粗蛋白含量相對(duì)較低的特點(diǎn)，說明混合菌種能很好地利用纖維原料。從蛋白酶活力上看，玉米秸稈的最高，其余的差異并不明顯。

2.5 最佳培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)

以初始含水量、pH 值、含氮量、硫酸銨與尿素的比例為考察因素，粗蛋白含量為衡定指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)（見表4），確定最佳培養(yǎng)基的配方以及試驗(yàn)因素的影響順序，分析結(jié)果見表5。

從R值分析可知影響試驗(yàn)結(jié)果的因素依次為C＞A＞B＞D，即對(duì)粗蛋白質(zhì)含量影響因素依次為含氮量、初始含水量、pH 值和硫酸銨與尿素的比例。從K 值和實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果都可以看出，A3B1C3D2發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量最高，即初始含水量為60%，pH 值為4.5，含氮量為2%，硫酸銨與尿素的比例為2∶1。

表3 不同輔料對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

表4 最佳培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素及水平

表5 正交試驗(yàn)方案和結(jié)果L9（34）

3 討論

3.1 初始含水量

水是發(fā)酵的主要媒質(zhì)，直接影響微生物的生長情況[15]，因而培養(yǎng)料的初始含水量是決定固態(tài)發(fā)酵成功與否的關(guān)鍵因素之一。初始含水量應(yīng)根據(jù)物料的性質(zhì)（細(xì)度、持水性）、微生物的特性（需氧、兼性厭氧或厭氧）、培養(yǎng)室條件（溫度、濕度、通風(fēng)狀況）等因素來決定[16]。在本試驗(yàn)過程中，當(dāng)初始含水量小于50%時(shí)，隨著含水量的增加，蛋白酶活力、纖維素酶活力、粗蛋白質(zhì)含量增加。主要是因?yàn)楹康蜁?huì)使微生物生長受抑制，發(fā)酵后期由于微生物生長及蒸發(fā)造成發(fā)酵物料較干，營養(yǎng)物質(zhì)傳遞困難，微生物難以生長，產(chǎn)量降低；當(dāng)初始含水量在50%～60%時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)都比較高，這是因?yàn)檫m宜的初始含水量，一方面有助于菌體吸收培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)和氧傳遞，另一方面有利于微生物代謝產(chǎn)物阻遏削減，促進(jìn)新陳代謝，從而促進(jìn)菌體的生長繁殖；當(dāng)初始含水量大于60%時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)隨著水分的增加而降低，主要是含水量高會(huì)減少基質(zhì)內(nèi)氣體的體積和氣體交換，不利于微生物的生長[17]。這個(gè)結(jié)果與侍寶路等[18]、張文佳等[7]研究的結(jié)果略有差異，他們研究認(rèn)為最佳的初始含水量為50%～70%，這主要是因?yàn)椋阂环矫婢N的選擇不一樣，另一方面輔料的選擇不同,因?yàn)椴煌妮o料的疏松性與透氣性不一樣。

3.2 氮源的選擇

固態(tài)發(fā)酵中菌體蛋白的增加需要培養(yǎng)料內(nèi)充足的氮源，研究表明，對(duì)于非蛋白氮源，菌種都有比較強(qiáng)的利用能力[19]。本試驗(yàn)選擇了尿素、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鎂和硝酸鈉作為出發(fā)氮源，結(jié)果表明，混菌組合能比較好地利用硫酸銨和尿素，這個(gè)結(jié)果與潘紅春等[20]、高磊[21]的研究結(jié)果一致。這主要是因?yàn)槟蛩亟?jīng)尿素酶作用后分解出NH3被微生物利用，硫酸銨分解為SO42-和NH4+，NH4+可以直接為菌體所利用，參與細(xì)胞內(nèi)含氮化合物的合成，并且SO42-可以降低發(fā)酵物的酸堿度，抑制雜菌的污染。但是相對(duì)于尿素，硫酸銨的氮含量較低，如果只用其作為氮源的唯一來源，不能夠充分滿足微生物的生長需求[21]。而硝酸銨分解為NO3-和NH4+,硝酸鈉和硝酸鎂分解為NO3-,而微生物利用NO3-的能力很低，只能利用NH4+，因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，通常以尿素和硫酸銨二者以一定的比例使用才能起到較優(yōu)的發(fā)酵效果。

3.3 輔料的篩選

微生物高繁殖的基礎(chǔ)是必須為微生物提供足夠的營養(yǎng)成分，尤其是碳源和氮源的提供，使得微生物的生長和產(chǎn)物形成的潛力得到充分發(fā)揮。固體發(fā)酵的原料一般包括兩大類，一類為發(fā)酵基質(zhì)，另一類為輔料[22]。本試驗(yàn)以豆渣為發(fā)酵基質(zhì)，輔料即為改善和提高培養(yǎng)基中碳和氮比例的營養(yǎng)填充物質(zhì)。本研究選用了肉粉、豆粕、魚粉、棉粕、酒精粉、玉米秸稈、醋糟、玉米粉和麩皮9 種物質(zhì)作為輔料，添加到豆渣中進(jìn)行混合菌微生物固體發(fā)酵，從粗蛋白質(zhì)含量提高率、纖維素酶活力和蛋白酶活力綜合指標(biāo)上來看，玉米秸稈以及醋糟作為輔料的效果比較好，這可能是與這兩種物質(zhì)含有的纖維素含量比較高有關(guān)，高纖維輔料一方面可能彌補(bǔ)了菌種生長的碳氮比[23]，另一方面改善了發(fā)酵物中的通透性。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，選擇輔料除了改善產(chǎn)物中的營養(yǎng)成分外，還應(yīng)該考慮易獲得性和成本等因素。山西省是一個(gè)醋糟資源比較豐富的省份，據(jù)統(tǒng)計(jì)，近幾年年產(chǎn)量達(dá)60 多萬噸，幾乎占全國總量的1/4[24],而且醋糟的價(jià)格比較便宜，使用其不但不影響發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)，而且利用了其資源，保護(hù)了環(huán)境。因此，本試驗(yàn)選擇醋糟作為輔料。

3.4 pH的選擇

初始pH值是影響混菌固態(tài)發(fā)酵豆渣的重要因素之一，pH 值一般通過影響菌體細(xì)胞膜上的電荷性質(zhì)來影響其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進(jìn)而影響混菌的發(fā)酵效果。在本試驗(yàn)中，當(dāng)初始pH值在4.0～6.0時(shí)發(fā)酵效果比較好，這與李思聰[25]、潘天玲等[26]報(bào)道的結(jié)果相似。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)主要是研究了固態(tài)發(fā)酵的初始含水量、pH 值、氮源以及輔料對(duì)豆渣發(fā)酵結(jié)果的影響，通過測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量、蛋白酶活力和纖維素酶活力，從而確定出豆渣固態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)料生產(chǎn)條件為：①豆渣∶麩皮∶醋糟=8∶1∶1；②初始含水量為60%；③pH 值為4.5；④含氮量為2%且硫酸銨與尿素的比例（N/N）為2∶1。