楊瑞虹，何 群，郝志英，徐變珍，李慧芳,徐 珍

(1.山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410078;3.山西省腫瘤醫(yī)院，山西 太原 030000)

苦參堿系從中藥苦參中提取分離出的生物堿，現(xiàn)代藥理研究表明苦參堿在保護(hù)肝臟和心腦血管、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的臨床應(yīng)用價值[1，2]。近年來大量的體內(nèi)外研究證實，苦參堿能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，在抗腫瘤方面具有明顯功效[2，3]。研究證實氨基甾體化合物對慢性髓性白血病K562細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用[4]。利用藥物拼合原理，將苦參堿的水解產(chǎn)物苦參酸與氨基甾體成酯，所得產(chǎn)物為新化合物，目前尚未有關(guān)有該化合物的研究報道，由于合成所用的兩個化合物均具有抗腫瘤活性，有望產(chǎn)生協(xié)同作用，提高苦參堿的抗腫瘤活性。結(jié)合苦參堿和氨基甾體化合物的抗瘤譜，選擇人髓性白血病K562細(xì)胞株為體外試驗細(xì)胞，K562細(xì)胞系建于CML急變期的患者，是第一個人類髓性白血病人工培養(yǎng)的細(xì)胞，已廣泛用作研究白血病的細(xì)胞模型[3-6]。本試驗旨在研究苦參酸-氨基甾體化合物(KSS-KH)對人髓性白血病K562細(xì)胞株增值及分化的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

K562細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院血液生理研究室提供，RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)，瓊脂(美國Sigma)，MTT試劑盒(美國Sigma)，流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)，苦參堿(KSJ 大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：110805-201709)，苦參酸-氨基甾體化合物(KSS-KH 課題組自制)，氨基甾體化合物(KH 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院血液生理研究室提供)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院血液生理研究室傳代保存，將K562細(xì)胞加入含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中，飽和濕度培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 樣品溶液配制及實驗分組 RPMI1640培養(yǎng)基用無菌雙蒸水溶解，碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.2～7.4，濾過除菌備用；KH、KSS-KH、 KSJ.KH(苦參堿和氨基甾體1∶1混合物)用二甲基亞砜(DMSO)分別配置成10-1M的儲備液，再用上述RPMI1640培養(yǎng)基分別稀釋成(10-4～10-8)為三個實驗組；空白對照組加入實驗組等量的RPMI1640培養(yǎng)基。

1.2.3 樣品對K562細(xì)胞液體培養(yǎng)的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞以每mL 5×104個加入培養(yǎng)體系，三個實驗組分別加入不同濃度(10-4～10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH，空白對照組加入實驗組等量的RPMI1640培養(yǎng)基，接種1 mL于24孔板中，每組平行接種3孔，培養(yǎng)5 d，用MTT計數(shù)細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 MTT比色法測定樣品對細(xì)胞增殖抑制作用 采用96孔板培養(yǎng)K562細(xì)胞，使每mL含5×104個細(xì)胞；三個實驗組分別加入不同濃度(10-4～10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH，空白對照組加入實驗組等量的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，飽和濕度培養(yǎng)5 d，離心、吸去上清；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心、吸去上清；每孔加入100 μL DMSO，低速震蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶物充分溶解；用酶聯(lián)免疫檢測儀，以溶劑DMSO孔為空白，在590 nm波長下測定各孔的吸光度(OD值)，計算細(xì)胞增殖抑制率。實驗重復(fù)三次。

1.2.5 瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài) 將105個K562細(xì)胞加入10 mL含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中；實驗組分別加入不同濃度(10-4～10-8)的KSS-KH，空白組加入實驗組等量的RPMI1640培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中，飽和濕度培養(yǎng)5 d，離心收集細(xì)胞，涂片，滴加瑞氏染液，固定細(xì)胞約1 min，再滴加等量PBS (pH值至6.4～6.8)緩沖液，使染液充分混勻，染色10 min，沖洗、涼干、鏡檢，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 對K562細(xì)胞增殖的抑制作用 KSS-KH、KH、KSJ.KH對細(xì)胞增殖的影響見表1，劑量抑制曲線見圖1。

表1 不同濃度藥物對K562細(xì)胞MTT值的影響

圖1 不同濃度藥物對K562細(xì)胞增殖抑制的影響

2.1.1 不同濃度氨基甾體化合物(KH)對K562細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度KH處理K562細(xì)胞5 d后，細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物的濃度增加而升高，各濃度抑制率具有顯著的差異性(P<0.05)，10-8M對K562細(xì)胞即有抑制作用，10-5M細(xì)胞增殖抑制率顯著提高(22.3%)，10-4M細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到94.1%。

2.1.2 不同濃度苦參堿和氨基甾體(1∶1)混和物(KSJ.KH)對K562細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度KSJ.KH處理K562細(xì)胞5 d后，細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物的濃度增加而升高，各濃度抑制率具有顯著的差異性(P<0.05)，10-4M對細(xì)胞增殖抑制作用與單獨使用KH接近，說明苦參堿和氨基甾體聯(lián)合使用，僅具有相加作用，但不呈現(xiàn)協(xié)同作用。

2.1.3 不同濃度苦參酸氨基甾體化合物(KSS-KH)對K562細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度KSS-KH處理K562細(xì)胞5 d后，結(jié)果顯示10-8～10-6M與對照組無顯著差異(P>0.05)，10-8M對K562細(xì)胞無抑制作用，10-7～10-5M細(xì)胞增殖抑制率均低于單獨使用KH及苦參堿和氨基甾體混和物(KSJ.KH)，但10-4M對細(xì)胞增殖的抑制作用顯著提高(98.8%)，與其他各濃度抑制率具有顯著差異性(P<0.05)，說明KSS-KH在較高濃度下對K562細(xì)胞具有較強的抑制作用。

2.1.4 比較相同藥物濃度下，不同實驗組之間的差異 在10-8～10-5M 各實驗組間對細(xì)胞的抑制率有顯著差異(P<0.05)；10-4M濃度下KH和KSJ.KH之間無顯著差異，但KSS-KH與KH、KSJ.KH組間有顯著差異(P<0.05)，說明在較高濃度下苦參酸氨基甾體化合物(KSS-KH)對K562細(xì)胞增殖的抑制率明顯強于其他兩組。

2.2 瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)

K562細(xì)胞經(jīng)處理，采用瑞氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。對照組未經(jīng)藥物處理，K562細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核和胞漿無明顯界線，細(xì)胞漿呈藍(lán)紫色；實驗組經(jīng)KSS-KH(10-6M)處理后，細(xì)胞體積增大、細(xì)胞染色質(zhì)變淺，細(xì)胞核漿比變小，呈現(xiàn)分化特征見圖2。

圖2 K562細(xì)胞形態(tài)對比(A.未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞;B.經(jīng)10-6 KSS-KH處理的細(xì)胞)

3 討論

慢性髓性白血病(CML)又稱為慢性粒細(xì)胞白血病，是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，以髓系細(xì)胞惡性增殖為特點，K562細(xì)胞系研究慢性髓性白血病的細(xì)胞模型。本試驗將目標(biāo)化合物苦參酸-氨基甾體(KSS-KH)與氨基甾體(KH)、苦參堿氨基甾體混合物(KSJ.KH)對K562細(xì)胞抑制作用進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將苦參酸-氨基甾體化合物對K562具有較強的抑制作用，說明將苦參堿水解，與氨基甾體形成酯，兩種藥物可能會產(chǎn)生協(xié)同作用；

形態(tài)學(xué)觀察K562細(xì)胞經(jīng)KSS-KH處理后，細(xì)胞體積變大，呈現(xiàn)分化特征，提示KSS-KH可能會通過誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化而發(fā)揮作用，但作用機制有待進(jìn)一步研究；苦參酸-氨基甾體化合物(KSS-KH)是利用苦參堿為原料進(jìn)行深度開發(fā)，充分利用我國獨特的中藥生態(tài)資源，發(fā)揮中醫(yī)藥在防治疑難病癥中的作用。目前慢性髓性白血病(CML)主要采用化學(xué)藥物和骨髓移植治療，骨髓移植受供體來源等限制難以廣泛使用，化學(xué)藥物治療中藥物對人體正常細(xì)胞會產(chǎn)生較大的毒性，而本課題利用苦參堿合成的新型化合物，可發(fā)揮天然產(chǎn)物毒性較低的優(yōu)勢，使其更安全有效地用于臨床，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價值。