俞 婷,周寶梅,徐 敏,耿玉闖,劉洪林
(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)
食源性致病菌(比如沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等)引起的疾病是全世界最重要的公共安全問題之一,也是全球食源性疾病高發(fā)病率和死亡率的重要因素。2015年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球食源性疾病負擔估算報告[1]顯示:2010年,全球發(fā)生約6億起食源性疾病,其中以非傷寒腸道沙門氏菌為主的病原體造成約23萬人死亡,而實際發(fā)生的疾病數(shù)量可能是報告數(shù)量的300~350倍。此外,有研究對食源性致病菌引起的疾病發(fā)病率進行估計[2],認為我國每年約有1億人患細菌性食源性疾病,然而由于報告體系不健全,監(jiān)測系統(tǒng)報告的發(fā)病人數(shù)遠少于此數(shù)據(jù)。從以上現(xiàn)狀來看,迫切需要一種高效、快速的致病菌檢測技術用于現(xiàn)場或臨床檢測,以達到預防、控制食源性疾病,完善食源性疾病監(jiān)測系統(tǒng)的目的。
細菌培養(yǎng)法是一種常用的致病菌檢測方法,樣品中的致病菌經(jīng)過幾天的增菌、分離培養(yǎng)后,可根據(jù)菌落特征、生化試驗或血清學鑒別判定致病菌種類,通過平板計數(shù)法對致病菌進行定量。但這種方法步驟復雜且耗時長,在等待培養(yǎng)結果時,不能明確病菌類別,通常使用廣譜抗生素對患者進行非針對性的過度治療,限制了緊急情況下食源性疾病的診斷和控制。近年來,聚合酶鏈式反應[3-4]、酶聯(lián)免疫吸附測定[5]等技術被越來越多地應用于食源性致病菌檢測,大大縮短了檢測時間。然而,這些技術仍存在假陰性、假陽性、步驟復雜、檢測成本高等問題,限制了其在現(xiàn)場或臨床診斷上的廣泛應用。因此,為了公共安全和人類健康、減少細菌耐藥性的產(chǎn)生,亟需發(fā)展一種簡便、快速、準確的致病菌檢測方法。
表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術具有靈敏度高、熒光背景低、前處理簡單、快速無損等優(yōu)點,在化學與生物傳感等領域有廣闊的應用前景,目前已被廣泛應用于檢測食品中農藥殘留、非法添加物、毒素等[6-9],在致病菌種類和耐藥性檢測方面也表現(xiàn)出應用潛力,有望發(fā)展成一種被廣泛接受的檢測技術。本文綜述了近5年來利用基于標簽和無標簽SERS技術檢測食源性致病菌的研究進展,介紹了常用的SERS活性納米結構,討論了SERS在實際樣品檢測中的應用;最后,對該技術目前存在的問題及今后的研究趨勢進行了總結和展望。
SERS是一種高靈敏的無損快檢技術,當分子吸附到特定金屬表面(如金或銀納米粒子)時,其非彈性光散射被極大增強。1974年,F(xiàn)leischmann等[10]第一次觀察到SERS現(xiàn)象,他們將吡啶吸附到粗糙銀電極上時意外發(fā)現(xiàn)吡啶分子的拉曼信號增強,并把此現(xiàn)象歸因于表面積增加導致吸附的吡啶分子數(shù)量增加而使信號增強。1977年,Jeanmaire等[11]及Albrecht等[12]均確認這一增強現(xiàn)象達105~106倍,遠遠超出分子吸附數(shù)量增加所能引起的信號增強,并提出由于電極表面效應增加了分子拉曼散射截面的觀點。隨后,Moskovits[13]提出這種增強由粗糙金屬表面?zhèn)鲗щ娮蛹w共振引起。經(jīng)過四十多年的發(fā)展,已有大量論文對SERS機理、增強基底的設計及其在各領域的應用進行研究。這些研究使拉曼技術獲得突破性進展,為克服普通拉曼散射弱的缺點提供了方法。
目前,電磁增強(EM)和化學增強(CE)是被廣泛認同的兩種增強機理。電磁增強是指當入射光與金屬結構作用時,電磁波可以引起金屬表面局域等離子體共振(LSPR),使金屬表面的局部電磁場強度增強2~5個數(shù)量級,這是SERS增強的關鍵。當待測分子靠近等離子體材料附近時,分子拉曼信號會顯著增強,產(chǎn)生表面增強拉曼光譜,且SERS強度隨著距離減小而逐漸增強。此外,當兩個納米顆粒足夠接近時,它們可以在間隙中產(chǎn)生極大的SERS增強,這種空間局域化區(qū)域被稱為“熱點”,其增強因子最高可達1011,如此高的增強有利于檢測各種共振和非共振分子[14-15]。化學增強是指被吸附在金屬表面的分子中的電子與金屬表面電子相互作用產(chǎn)生的增強,雖然化學增強的增強因子只有10~100倍,但其與電磁增強的協(xié)同關系,可以顯著改善SERS的增強特性[16]。在食源性致病菌檢測中,“熱點”效應發(fā)揮了主要作用:金屬納米材料通過靜電吸附或識別配體作用結合到致病菌表面,納米材料之間形成豐富的“熱點”,使致病菌表面分子或拉曼標簽信號極大地增強,從而實現(xiàn)致病菌的靈敏直接或間接SERS檢測。
為達到理想的致病菌檢測效果,研究人員致力于制備高靈敏、穩(wěn)定、可重復、選擇性好的SERS基底,大致可分為3類:
(1)納米溶膠及其組裝:金、銀納米溶膠是廣泛使用的SERS基底,成本低、制備方便且SERS性能優(yōu)異,金納米顆粒形貌規(guī)則、尺寸均勻,銀顆粒的SERS活性更強但不太穩(wěn)定,金銀核殼結構顆粒則兼顧了兩者的優(yōu)點[17-18];為進一步優(yōu)化SERS增強效果,研究人員制備了形態(tài)各異的納米結構,如金納米線囊泡[19]、刺狀金顆粒[20]等,它們具有豐富的尖端,能提供更強的電磁增強。Zhou等[21]合成了骨頭形狀的金納米棒(圖1A),其頂點具有更多熱點,拉曼信號強度比普通金棒增強118倍;基于納米骨的SERS傳感器用于檢測大腸桿菌O157∶H7,檢測限可低至3 CFU/mL。此外,相比于溶膠中納米顆粒的隨機聚集,可控聚集形成的“熱點”,如納米顆粒的二聚組裝[22-23]、核-衛(wèi)星納米結構[24]等,既能實現(xiàn)檢測靈敏度又可保證檢測的重現(xiàn)性,已引起研究人員的廣泛興趣。Wu等[23]利用帶兩個巰基的金屬絡合物合成金顆粒二聚體并修飾志賀氏菌的特異性適配體,對食品中的志賀氏菌檢測表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏度,檢測限為10 CFU/mL。
(2)固氣界面納米結構:溶膠類SERS基底易受環(huán)境因素影響,儲存穩(wěn)定性相對較差,因此,有研究通過物理吸附、化學吸附或毛細力驅動等手段將納米材料固定于玻片、聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜、濾紙[25-27]等固體襯底上來提高基底的穩(wěn)定性和便攜性。Qiu等[28]通過在硅片上控制納米棒溶膠的緩慢蒸發(fā),制得垂直的納米棒陣列(圖1B),可提供大規(guī)模均勻、高靈敏的SERS基底,實現(xiàn)對單增李斯特菌、木糖葡萄球菌、屎腸球菌的無標簽檢測及區(qū)分。此外,還有研究通過電子束光刻法或壓印法制備形狀、大小、間隙可控的納米圖案[29-30],鍍上金膜后得到穩(wěn)定性、均一性較好的基底。
(3)液相界面等離子體陣列:液相界面組裝的納米顆粒陣列具有可調諧、可重復、多相可及性等優(yōu)點,是SERS技術實用化的突破方向之一。本課題組在水/油界面上構筑了具有界面自愈合、形狀自適應的三維納米陣列(圖1C),通過改變容器的表面浸潤性實現(xiàn)了三維陣列對水、油兩相的可逆包覆[31];調節(jié)界面的納米顆粒密度可優(yōu)化SERS增強效果[32]。此外,我們提出了利用有機溶劑作為內標校正光譜信號的策略,實現(xiàn)了兩相中不同溶解度分子的可靠、定量檢測[33]。這種液相等離子體陣列已被成功用于食品中農藥殘留、油脂氧化、食用油中多環(huán)芳烴等[33-35]的檢測。目前食源性致病菌檢測中的基底主要為前兩類,本課題組正在開展利用液相界面等離子體陣列檢測致病菌的研究。
無標簽SERS檢測,也稱直接檢測,該法通過將SERS基底直接與致病菌懸浮液進行孵育,使致病菌靠近基底表面,增強致病菌拉曼信號并獲得其固有指紋信息,具有操作簡便、快速、成本低等優(yōu)點。由于致病菌生物組成復雜且光譜信息豐富,大多數(shù)生物分子拉曼散射截面相對較小,實際樣品中雜質較多等客觀因素的存在,無標記檢測的研究主要致力于3個方面:(1)從復雜樣品中分離致病菌,減少其他成分對致病菌SERS光譜的干擾;(2)制備靈敏度高、重現(xiàn)性好的SERS基底,提高無標簽檢測能力;(3)解析致病菌的SERS光譜,結合多元統(tǒng)計分析方法和機器學習算法提取光譜中有效信息,達到鑒別、分類等目的。
目前已有很多研究利用不同納米結構測量純培養(yǎng)致病菌的SERS光譜,并嘗試對其特征峰歸屬進行分配。致病菌的SERS光譜主要來源于細胞壁的成分,包括肽聚糖、蛋白質、多糖、脂質、核酸等。一些常見的峰如649、730、958、1 030、1 241、1 325、1 457、1 580 cm-1等(歸屬見表1),在不同致病菌SERS光譜中普遍存在,但由于分子含量、分布不同等原因,相對強度存在差異。如革蘭氏陰性菌細胞壁中肽聚糖含量比革蘭氏陽性菌少,因此革蘭氏陰性菌SERS光譜中來源于肽聚糖糖苷環(huán)振動模式的730 cm-1處的峰強比革蘭氏陽性菌弱[36]。由于致病菌在分子水平上組成復雜,盡管已經(jīng)對一些特征峰來源進行解釋,但不同研究人員給出的歸屬并不相同,不利于統(tǒng)一分析,目前仍缺乏一個完整的SERS光譜峰分配數(shù)據(jù)庫。
表1 致病菌SERS光譜的拉曼位移和歸屬分配[36-40]Table 1 Raman shift and tentative band assignment of the SERS spectra of pathogen[36-40]
細胞壁成分差異會引起SERS光譜差異,使得不同屬、不同種、同種但不同來源的菌株及耐藥菌株的分類判別成為可能。然而致病菌SERS光譜指紋信息豐富,一般難以通過直接觀察判別不同致病菌(圖2A),因此,大多數(shù)研究通常借助多元統(tǒng)計分析方法對數(shù)據(jù)進行“降維”,提取光譜中有效信息,建立分類模型。常見的方法有主成分分析(PCA)[41-42]、線性判別分析(LDA)、分層聚類分析(HCA)[43]、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)[44]。Liu等[45]利用帶正電荷的金納米棒作為增強基底,分別采集了4種假單胞菌的SERS光譜,利用PCA和LDA實現(xiàn)了不同種假單胞菌的分類;利用HCA得到的聚類結果與16S rRNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹一致。Witkowska 等[40]在粗糙銀盤表面沉積金顆粒作為SERS基底,結合PCA實現(xiàn)了基因組不同的單增李斯特菌菌株及基因組相同但引入了不同抗性基因的菌株的區(qū)分。對于組間差異不夠明顯的樣品或信噪較低的光譜數(shù)據(jù)集,有研究利用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)[46-47]、遺傳算法(GA)[27]或卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(CNN)[48](圖2B)濾除與分類信息無關的噪音,提取特征信息,提高模型的判別能力和效果。
圖2 來自30個菌株的2 000條光譜的平均值(粗體)(A)和卷積神經(jīng)網(wǎng)絡示意圖(B)[48]Fig.2 Averages of 2 000 spectra from 30 isolates(in bold)(A)and schematic illustration of convolutional neural network(B)[48]
減少實際樣品中雜質干擾、獲得可靠的致病菌指紋圖譜是進行后續(xù)光譜分析與處理的前提。近年來,對實際樣品中致病菌進行直接檢測的研究相對較少,主要分為兩類:(1)將納米材料固定在硅片上,滴加樣品溶液進行孵育后用超純水沖洗除去雜質[49];(2)利用磁性納米顆粒從樣品中分離致病菌,加入納米顆粒采集致病菌SERS光譜[50]。捕獲機制主要是帶正電納米材料與帶負電致病菌之間的靜電吸附作用及4-巰基苯硼酸(4-MPBA)、萬古霉素與細菌細胞壁中肽聚糖的共價或氫鍵結合。其中,4-MPBA的特征峰會掩蓋致病菌的部分特征峰[51],雖然不影響不同種致病菌的分類判別,但可能不利于差異不大的菌種判別。利用固氣界面進行檢測時,近場等離子效應只能影響細菌與基底接觸的界面,這意味著只有界面附近的拉曼信號可以增強。因此,Ge等[26]用修飾萬古霉素的銀包金納米棒陣列捕獲大腸桿菌、沙門氏菌或木糖葡萄球菌后,進一步將銀納米片沉積到細菌間隙中,盡可能獲得完整的細菌指紋信息;納米片和納米陣列之間的協(xié)同增強提高了直接檢測的靈敏度,檢測限可達1 000 CFU/mL。Wang等[52]利用磁性納米顆粒捕獲致病菌后,再加入銀包金納米顆粒覆蓋致病菌未被占據(jù)的表面,填補磁性顆粒與致病菌間的間隙,提供大量熱點,實現(xiàn)了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的高靈敏檢測。盡管目前研究通過直接檢測獲得了較低的檢測限,但在致病菌濃度較低時,僅出現(xiàn)少數(shù)幾個特征峰,雖可實現(xiàn)致病菌檢出,但可能不利于利用算法進行分類判別。
無標簽檢測所需致病菌濃度普遍較高,得到的光譜復雜且難以分析,實現(xiàn)高靈敏檢測和定量分析仍有一定難度,因此,目前對致病菌進行高靈敏的定性定量檢測主要依賴基于標簽的SERS檢測方法,檢測限低至幾至幾十CFU/mL。一般來說,檢測時首先用識別配體功能化的納米顆粒(捕獲探針)從樣品中捕獲致病菌,然后加入修飾識別配體和報告分子的納米顆粒(信號探針)形成“三明治”復合物,產(chǎn)生熱點及增強的SERS信號;識別配體用于特異性捕獲靶標致病菌,而報告分子的信號強度反映該致病菌的含量。常見的報告分子有4-巰基苯甲酸(4-MBA)、4-巰基吡啶(4-MPY)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等,報告分子有較大的拉曼散射截面和較窄的特征峰,有利于同時檢測多種致病菌;也有少數(shù)報道將用于納米顆粒功能化的蛋白[53]、DNA[54]作為報告分子。常見的識別配體有抗體和核酸適配體。目前,抗體已被廣泛用于各種免疫檢測試驗中,其制備技術成熟,但價格昂貴、修飾困難;適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列,與抗體相比,具有合成簡單、成本低、易于修飾、穩(wěn)定性高等優(yōu)點;但目前通過篩選得到的適配體較少,只能用于少數(shù)菌的檢測。隨著指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(SELEX)的不斷進步,將來適配體可能成為抗體的潛在替代品。此外,萬古霉素[55]、3-巰基苯硼酸[56-57]等小分子價格低廉,能與細菌細胞壁中的肽聚糖結合,可作為廣譜識別配體與特異性抗體、適配體一起使用,不僅能降低檢測成本,還不影響檢測效果。
檢測時為除去樣品雜質及未結合的信號探針,提高檢測準確性,有研究將復合物離心洗滌2~3次后采集SERS光譜[58],但加入離心步驟增加了檢測時間和程序,并在一定程度上影響探針的穩(wěn)定性。近年來,磁性納米粒子因便于分離被越來越多地應用于致病菌的SERS檢測[59-61]。Li等[62]利用適配體功能化的磁性納米顆粒作為捕獲探針,通過施加外部磁場從實際樣品中分離、濃縮大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌,結合修飾適配體和報告分子的SERS標簽,實現(xiàn)了樣品中兩種細菌的同時靈敏檢測(圖3A)。此外,在磁性納米顆粒表面覆蓋一層貴金屬外殼制備的磁性等離子體顆粒(MPP),同時具有磁性響應和SERS性能,在SERS傳感領域具有巨大的應用前景[63]。MPP的合成方法主要有兩種:(1)磁性納米顆粒表面修飾氨基后直接吸附已合成的貴金屬納米顆粒,但納米顆粒通常分布不均勻[64];(2)利用化學結合或靜電吸附將金種子結合在磁性顆粒表面,通過種子介導生長法在磁性顆粒周圍形成連續(xù)而均勻的外殼[63,65](圖3B)。You等[53]合成了殼聚糖包被的淀粉磁珠,在其表面原位合成AuNPs形成致密包裹的外層并進行抗體功能化,利用這種磁珠捕獲、分離、濃縮樣品中大腸桿菌O157∶H7,可以檢測到單個大腸桿菌的信號,為食品中致病菌的檢測提供了一種高靈敏、強有力的手段。此外,也有研究將捕獲探針固定在固體支撐材料上,用超純水或緩沖液沖洗即可除去雜質及未結合探針,無需離心及重懸等復雜步驟[25]。
圖3 磁性顆粒捕獲致病菌用于檢測的示意圖[62](A)與(B)種子生長法合成磁性等離子體顆粒示意圖[63]Fig.3 Schematic illustration of magnetic particle capture for detection of pathogen[62](A)and synthesis of magnetic plasma particles by seed growth method [63](B)
基于標簽的SERS檢測方法已證明可以對致病菌進行高靈敏檢測(表2),但仍存在一些問題需要改進:SERS探針制備過程相對復雜且耗時久,不能長時間存放;檢測時探針與致病菌孵育時間較長,通常需要1~2 h;識別配體的靶標分子在致病菌表面分布不均,導致探針分布不均,可能影響信號重現(xiàn)性。因此,仍需探索快速、簡單、重現(xiàn)性好的間接檢測方法。
表2 間接檢測在食源性致病菌檢測中的應用Table 2 Application of indirect methods in the detection of foodborne pathogens
當前,結合新型樣品分離和光譜解析等技術方法,發(fā)揮SERS檢測手段的優(yōu)勢,開展致病菌檢測研究是一個重要趨勢。側向流動檢測(LFA)是一種免疫層析技術,具有成本低、操作簡便、快速等優(yōu)點,在即時檢測(POCT)中受到廣泛關注,但存在靈敏度低、定量分析有限的缺點。為了解決這些問題,有報道開發(fā)了基于SERS的側向流動檢測方法[67,71-74]。He等[73]合成的鉑包覆的金納米棒(AuNPs@Pt)具有較強的電磁場強度和較好的穩(wěn)定性。當樣品溶液被滴加到樣品墊上并在毛細作用力下流動到結合區(qū),空腸彎曲桿菌將與4-MBA、抗體功能化的AuNPs@Pt特異性結合,復合物繼續(xù)流過硝酸纖維素膜至信號線被二抗捕獲。在785 nm激光激發(fā)下,采集4-MBA的SERS光譜,信號強度與空腸彎曲桿菌濃度呈良好的線性關系,檢測限為50 CFU/mL。此方法結合了LFA和SERS技術的優(yōu)點,操作簡便、快速、靈敏度高,具有很大的商業(yè)應用潛力。
基于SERS的微流控平臺具有便攜、樣品體積小、檢測速度快等優(yōu)點[75],并能提供一個較穩(wěn)定的工作環(huán)境以改善SERS檢測的穩(wěn)定性和重復性[76],近年來引起了研究人員的極大興趣。此外,微流控平臺可將樣品預處理、富集、靶標分選、檢測等多個步驟集成到一塊芯片上,自動化程度高,簡化了檢測程序。在致病菌檢測應用中,SERS與微流控技術的結合操作簡單、速度快、儀器小,在快速即時分析方面具有很高的潛力且可以檢測到極低水平的致病菌[77],有望成為實際應用的突破方向之一。
近年來,以卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(CNN)為代表的深度學習算法成為光譜分析、模型建立的一個新研究熱點。CNN受動物視覺皮層中神經(jīng)元復雜連接模式的啟發(fā),通常由卷積層、池化層、全聯(lián)層組成,這些不同功能的層組成神經(jīng)網(wǎng)絡,逐步提取光譜數(shù)據(jù)中的特征并進行分類,在信噪比較低的光譜數(shù)據(jù)處理方面表現(xiàn)出強大的優(yōu)勢[78]。Ho等[48]將CNN應用于光譜采集時間為1 s、信噪比為4.1的30種常見臨床分離株單細胞SERS光譜分析,獲得了比常見分類方法更高的準確性,并能減少光譜預處理及變量選取步驟,為提高致病菌無標記檢測靈敏度提供了方向。隨著深度學習算法的不斷優(yōu)化,結合算法的SERS技術有望向更準確、廣泛的方向發(fā)展。
SERS作為一種靈敏度高、快速、無損的新興檢測技術,在食源性致病菌檢測方面已表現(xiàn)出很大的應用潛力與前景,但要發(fā)展成為一種廣泛使用的快檢技術,還存在一些問題和改進空間。對于直接檢測而言,(1)制備超靈敏、重現(xiàn)性好的SERS基底仍是檢測的關鍵;大多數(shù)研究中SERS基底與致病菌表面接觸有限,采集的SERS光譜未能全面地反映致病菌指紋信息;(2)不同SERS基底、樣品前處理手段、光譜采集參數(shù)及預處理方法都會影響SERS的背景、峰強度、峰位置,因此SERS方法標準化是用于實際檢測的前提;(3)目前的直接檢測研究均基于不同的技術和參數(shù),得到的SERS光譜難以進行統(tǒng)一分析和利用。在SERS方法標準化后,應建立一個食源性致病菌光譜數(shù)據(jù)庫,全面收集不同種類致病菌、不同生長階段、承受不同環(huán)境壓力時的SERS光譜以及混合菌的混合光譜,結合多元統(tǒng)計分析和機器學習算法對光譜數(shù)據(jù)進行挖掘和比較,為致病菌檢測提供更可靠的工具。
對間接檢測而言,大多數(shù)方法已能滿足金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌的檢測需求,但檢測某些限量要求嚴格[79]的致病菌(如沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7等)時,還需開發(fā)低至單個致病菌檢測限的SERS基底。此外,實際檢測時樣品中非致病菌組分可能干擾檢測結果,選擇合適的樣品前處理手段或選擇性好的SERS基底仍是實際應用的前提。當前,雖然SERS技術尚未應用于實際檢測,但隨著SERS基底的不斷優(yōu)化、各種便攜式和手持式拉曼光譜儀的出現(xiàn)以及與其他技術聯(lián)用的發(fā)展,SERS有望成為一種可靠的常規(guī)技術,實現(xiàn)食源性致病菌的快速、現(xiàn)場檢測,幫助預防和控制食源性疾病。