李可欣，羅幸玲，張凌燕，黃沛力

（1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京100069；2.環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069）

納米二氧化硅（silica nanoparticles，NPSiO2）是由二氧化硅顆粒組成的團(tuán)聚體[1]，由于生物相容性好，性質(zhì)穩(wěn)定，已被廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品的研發(fā)與生產(chǎn)[2]。調(diào)查顯示，人們每天可從食品添加劑中攝取1.8 mg的NPSiO2，并且美國食品藥品監(jiān)督管理局開始使用NPSiO2作為癌癥的靶向探針進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)[3]。由此可見，環(huán)境暴露、職業(yè)暴露和醫(yī)源性暴露等多種途徑可使人們接觸到NPSiO2。因此，深入研究NPSiO2對(duì)人類健康的影響具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。已有研究表明，盡管NPSiO2在生物體的代謝速度較快，但長期暴露仍可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理和生理變化，甚至具有全身毒性[4-6]。NPSiO2可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-9]，且其對(duì)細(xì)胞損傷作用存在尺度效應(yīng)，即粒徑越小，損傷越明顯[10-11]。金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一類廣泛存在于生物體中的抗氧化蛋白，由于含有大量巰基，清除ROS的能力明顯強(qiáng)于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽[12]。但當(dāng)MT結(jié)構(gòu)遭到破壞時(shí)，其清除ROS的能力減弱，易造成ROS在體內(nèi)的蓄積，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷。NPSiO2所引起機(jī)體的氧化損傷是否與其對(duì)MT結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)，迄今仍鮮有報(bào)道。本研究以20，60和100 nm的NPSiO2（NPSiO2-20 nm，NPSiO2-60 nm和NPSiO2-100 nm）作為研究對(duì)象，應(yīng)用圓二色譜法研究NPSiO2對(duì)MT結(jié)構(gòu)的影響，同時(shí)與人類血液中含量最多的人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）進(jìn)行對(duì)比研究，探討NPSiO2致生物體氧化損傷的毒作用機(jī)制，為NPSiO2的生物安全性評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

NPSiO2-20 nm，NPSiO2-60 nm 和 NPSiO2-100 nm，美國Nano Composix公司。MT和HSA，美國Sigma-Aldrich公司。透射電子顯微鏡（JEM-1400 plus），日本電子公司；動(dòng)態(tài)光散射儀（NanoZS90），英國Malvern公司；圓二色光譜儀（J-810），日本JASCO 公司；超純水機(jī)（Mili-Q），法國Milipore公司；超聲波清洗器（KQ3200E型），江蘇昆山市淀山儀器；漩渦振蕩器（MVS-1），北京金紫光科技；超低溫冰箱（MDF-U3386S），日本SANYO公司。

1.2 NPSiO2的表征

使用超純水配制NPSiO2-20 nm 5 g·L-1，NPSiO2-60 nm 10 g·L-1和NPSiO2-100 nm 10 g·L-1溶液，超聲振蕩30 min后滴于支持膜上，使NPSiO2在支持膜上均勻分散，置干燥器中干燥，待其完全干燥后，使用透射電子顯微鏡觀察不同粒徑NPSiO2的形態(tài)；分別移取1.0 mL至1 cm比色杯中，用動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量NPSiO2的粒徑分布。

使用PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.4）精確配制MT 0.2 g·L-1和HSA 0.25 g·L-1溶液，分別與3個(gè)濃度（0.05，0.5和5 g·L-1）的NPSiO2-20 nm，NPSiO2-60 nm和NPSiO2-100 nm按體積比1:1混合后，于25℃反應(yīng)30 min，使用圓二色光譜儀檢測(cè)MT和HSA圓二色譜的變化，使用PBS緩沖液作為空白進(jìn)行校正。掃描波長為 190～300 nm，掃描速度為50 nm·min-1，響應(yīng)時(shí)間為1 s。取3次掃描的結(jié)果以x±s表示，使用 Spectra Manager Version2軟件分析蛋白質(zhì)4種二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）含量的變化。

2 結(jié)果

2.1 NPSiO2的表征

NPSiO2-20 nm,NPSiO2-60 nm和NPSiO2-100 nm的形態(tài)如圖1所示。3種粒徑的NPSiO2均呈圓形，粒徑分布均勻且分散好，其粒徑大小與標(biāo)注的尺寸大小基本一致。NPSiO2-20 nm，NPSiO2-60 nm和NPSiO2-100 nm的水合粒徑如圖2和表1所示，由于范德華力的作用，3種粒徑的NPSiO2水合粒徑均略有增加。

Fig.1 Morphology of silica nanoparticles（NPSiO2） by transmission electron microscope.NPSiO2was diluted with ultrapure water respectively,and dropped on the support film after 30 min of ultrasonic vibration,then dispersed evenly on the support film and placed in a desiccator to dry.After NPSiO2 was completely dried,the transmission electron microscope was used to observe the size and shape of NPSiO2of different particle sizes.

Fig.2 Hydrated particle size distribution charts of NPSiO2.NPSiO21.0 mL was pipetted into a 1 cm cuvette respec?tively,then dynamic light scattering instrument was used to mea?sure the hydrated particle size of NPSiO2.

Tab.1 Hydrated particle size of NPSiO2

2.2 NPSiO2對(duì)MT和HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

不同粒徑、不同濃度NPSiO2對(duì)MT和HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響如圖3、圖4和表2所示。

由于MT中缺乏芳香族氨基酸，所以其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不存在α-螺旋[13]。3種粒徑的NPSiO20.05 g·L-1使MT的β-折疊在4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例減少、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲所占比例增加，其中NPSiO2-60 nm 0.05 g·L-1對(duì)MT的β-折疊結(jié)構(gòu)影響較為明顯。3種粒徑的NPSiO20.5和5 g·L-1可使MT的β-折疊在4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例減少、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占比例增加，但無明顯的粒徑-濃度關(guān)系。

Fig.3 Circular dichroism chromatograms of metallothionein(MT,A)and human serum albumin(HSA,B)after interaction with NPSiO2.MT 0.2 g·L-1and HSA 0.25 g·L-1were mixed with NPSiO2at a volume ratio of 1∶1,at 25℃ for 30 min,the circular dichrograph was used to measure the secondary structure of the protein in the mixed solution.PBS buffer was used as a blank for calibration.

Fig.4 Circular dichroism chromatograms of MT(A)and HSA(B)after interaction with NPSiO2.See Fig.3 for MT and HSA treatment.

Tab.2 Secondary structure of MT and HSA after interaction with NPSiO2

不同粒徑的NPSiO2均可使HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。NPSiO2-20 nm 0.05g·L-1可使HSA的α-螺旋在4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例增加、β-折疊所占比例減少；NPSiO20.5和5 g·L-1使HSA的α-螺旋和無規(guī)卷曲在4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例減少、β-折疊所占比例增加。NPSiO2-60 nm和NPSiO2-100 nm均可使HSA中α-螺旋和無規(guī)卷曲在4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例減少、β-折疊所占比例增加，但無明顯的粒徑-濃度關(guān)系。

NPSiO25 g·L-1使HSA 中 β-轉(zhuǎn)角的出現(xiàn)受NPSiO2粒徑大小的影響，粒徑越大，出現(xiàn)的β-轉(zhuǎn)角在4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例越多。

3 討論

近年來，由于顆粒分布均勻，裝載量大，NPSiO2作為藥物分子、基因和蛋白等的載體通過多種方式進(jìn)入人體血液循環(huán)的機(jī)會(huì)大大增加[14]。也正因如此，美國國家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所和國際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織已將NPSiO2列入了毒性評(píng)價(jià)范圍。研究表明，NPSiO2可通過負(fù)調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素6受體/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白/組織因子信號(hào)通路的微RNA451a，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)血液凝結(jié)[15]。NPSiO2在RAW264.7細(xì)胞系和小鼠中可誘發(fā)促炎反應(yīng)和氧化應(yīng)激[5]。人群調(diào)查結(jié)果顯示，在高NPSiO2暴露場所的工人中，系統(tǒng)性硬化癥患者血清中硅含量普遍較高。硅元素的蓄積可導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病，如彌漫性硬皮病伴肺纖維化[16]。不僅如此，NPSiO2與體內(nèi)生物大分子相互作用的結(jié)果與其自身粒徑大小也有關(guān)系。Marichal等[10]使用不同粒徑（10，30和80 nm）的NPSiO2與可溶性酵母蛋白提取物相互作用，吸附等溫線表明，吸附蛋白的數(shù)量隨NPSiO2粒徑的增大而增加，大粒徑NPSiO2的每個(gè)表面單位吸附的蛋白更多。Patwardhan等[11]研究了肽鏈在3種粒徑（15，82和450 nm）NPSiO2上的吸附，發(fā)現(xiàn)NPSiO2的酸度隨著粒徑的增大而增加，堿性越強(qiáng)的肽對(duì)酸性越強(qiáng)的納米顆粒的吸引力越大。

MT是富含半胱氨酸、低分子質(zhì)量（7 ku）、熱穩(wěn)定高且能與金屬結(jié)合的蛋白質(zhì)[17]。由于具有與重金屬結(jié)合的特性，MT常用于汞和鎘等重金屬的排毒，維持銅和鋅等必需金屬的穩(wěn)定狀態(tài)，并在抗氧化、防DNA損傷、提高細(xì)胞存活率、減少細(xì)胞凋亡和增殖等方面發(fā)揮作用[18]。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MT對(duì)納米銀（silver nanoparticles，AgNP）有很高的親和力，可在AgNP表面附著和聚集。AgNP的粒徑不同，其表面附著MT的含量和聚集后的大小也不同。Hao等[20]則發(fā)現(xiàn)，納米粒子的粒徑不同，其表面曲率也不同，不同的表面曲率會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的吸附產(chǎn)生不同的空間位阻，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的吸附數(shù)量和密度聚集的幾何形狀不同，對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響不同。本研究結(jié)果表明，NPSiO2-60 nm對(duì)MT β-折疊影響較顯著，可能與NPSiO2-60 nm和MT的自身結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，更深入的原因有待進(jìn)一步研究。

與MT不同，HSA是一個(gè)具有585個(gè)氨基酸殘基、相對(duì)分子質(zhì)量為66.5 ku的生物大分子，是人血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)[21]。高濃度的HSA對(duì)多種化學(xué)物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力[22]，極易與它們結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。HSA構(gòu)象的改變會(huì)對(duì)其功能產(chǎn)生影響。天然HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)的圓二色特征光譜有 2處，分別在 208 nm（π-π＊）和 222 nm（n-π＊）處，β-折疊的圓二色特征光譜出現(xiàn)在215 nm處[23]，HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與吸收帶強(qiáng)度的變化有關(guān)。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，加入富勒烯后，HSA的α-螺旋顯著減少，β-折疊和無規(guī)卷曲略有增加，表明與富勒烯相互作用后HSA的生物學(xué)活性降低。Maji等[25]發(fā)現(xiàn)，與AgNP反應(yīng)后，HSA中α-螺旋減少，但β-折疊和無規(guī)卷曲增加，表明與AgNP反應(yīng)后HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)略微展開。本研究結(jié)果表明，游離HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含52.2%的α-螺旋、13.8%的β-折疊和33.9%的無規(guī)卷曲，與文獻(xiàn)[26]報(bào)道相近。與NPSiO2反應(yīng)后，HSA中α-螺旋減少，β-折疊增加，并出現(xiàn)了β-轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲略有減少。Simon等[27]研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度的納米金（13 nm）可使HSA的α-螺旋增加、β-折疊減少；而Maji等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在AgNP（17.8 nm）與HSA反應(yīng)的質(zhì)量濃度比為2∶1和1∶1時(shí)，濃度較高的AgNP會(huì)使HSA的α-螺旋和無規(guī)卷曲減少、β-折疊增加。這是由于納米粒子可與HSA中主要多肽鏈的氨基酸殘基結(jié)合，并破壞氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使氨基酸殘基暴露于疏水腔中，導(dǎo)致在HSA中形成更加不緊密的構(gòu)象狀態(tài)，從而引起HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[29]。本研究結(jié)果表明，NPSiO2-20 nm在0.05 g·L-1時(shí)（與HSA 0.25 g·L-1的質(zhì)量濃度比為1∶5）使HSA的α-螺旋增加、β-折疊減少；隨著濃度增加（0.5和5 g·L-1）（與HSA的質(zhì)量濃度比為2∶1和20∶1）NPSiO2-20 nm使HSA的α-螺旋和無規(guī)卷曲減少、β-折疊增加。研究報(bào)道，與NPSiO2反應(yīng)后，HSA蛋白結(jié)構(gòu)略有展開，蛋白穩(wěn)定性降低[30]。

NPSiO2對(duì)MT和HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響并無明顯的粒徑-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系，可能與納米顆粒自身所具有的獨(dú)特性質(zhì)有關(guān)。即使?jié)舛认嗤?，不同粒徑的NPSiO2溶液中NPSiO2的粒子數(shù)、總表面積也會(huì)不同，每個(gè)納米粒子表面負(fù)載的蛋白量也可能不相同，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響也會(huì)不同。同時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，NPSiO2的表面曲率不同，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響也會(huì)不同。因此，對(duì)NPSiO2對(duì)MT和HSA結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行深入研究非常必要。

綜上所述，NPSiO2可使MT和HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且NPSiO2對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響強(qiáng)于對(duì)MT二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。