王 陳，石 童，陳學軍，張瑞華，李麗琴

（國民核生化災害防護國家重點實驗室，北京 102205）

納曲酮主要作為阿片類毒品依賴者脫毒后預防復吸的輔助藥物［1-2］，最近也被用于治療酒精成癮［3-4］。目前上市產(chǎn)品僅有片劑，由于首過效應嚴重，口服生物利用度低（5%～40%），需要多次服藥，患者依從性差，造成在抗復吸治療中的脫失率較高。因此，為提高患者的使用依從性，減少服藥次數(shù)，國內外研究者致力于開發(fā)多種長效制劑。一方面開發(fā)多種納曲酮給藥系統(tǒng)，包括透皮制劑、微針給藥系統(tǒng)、微球植入制劑、口服緩釋制劑等［5-6］；另一方面，利用納曲酮存在活性羥基的結構特點，開展酯化前體藥物研究［7-13］，以提高生物利用度。國內外已有文獻報道應用液相色譜-串聯(lián)質譜法（liquid chro?matography-tandem mass spectroscopy，LC-MS/MS）開展納曲酮的藥動學研究［14-17］。本研究建立了血漿用量少、靈敏度更高的方法，對納曲酮-3-O-辛酸酯在兔體內的藥動學進行研究，并與納曲酮原型藥物的藥動學參數(shù)進行差異性比較，為該化合物的實際應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

鹽酸納洛酮（批號：112K0747）和色譜純甲醇（批號：WXBB0253V），美國Sigma公司；納曲酮和納曲酮-3-O-辛酸酯（純度＞99%），防化研究院合成，化學結構式見圖1。色譜純甲酸（批號：4022536003719），德國Merck公司；分析純甲基叔丁基醚（批號：20130518），天津光復精細化工研究所；分析純氫氧化鈉（批號：20130822），北京化工廠。Agilent 1200/6410 LC/QQQ系統(tǒng)，美國安捷倫公司；Genie Vortex-2型渦旋振蕩器，美國Scientific Industries公司；Sigma 1-14高速離心機，德國Sigma公司；N-EVAP型氮吹儀，美國Organonation Asso?ciates公司；DT5-4B型低速臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司。

Fig.1 Chemical structures of naltrexone（NTX），naloxone and naltrexone-3-O-caprylate.

1.2 動物

12只新西蘭大耳白兔，體重2.0～2.5 kg，成年，雌雄各半，由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司提供，合格證號為SCXK（京）2015-0005。實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0017。飼養(yǎng)條件：溫度保持在21～23℃，濕度保持在45%～75%，自由攝食飲水。本研究的動物使用方案獲防化研究院實驗動物福利與倫理委員會批準。

1.3 給藥方案和樣品采集

選用新西蘭大耳白兔，雌雄各半，隨機分成2組，每組6只，分別im給予納曲酮1 mg·kg-1或納曲酮-3-O-辛酸酯1.2 mg·kg-（1與納曲酮1 mg·kg-1等摩爾劑量）。各組動物給藥前及給藥后（納曲酮組：2.5，5，10，20，30，40，60，90，120，150 和240 min；納曲酮3-O-辛酸酯組：5，15，30，60，120，240，360，480，600，720和1440 min）分別耳緣靜脈取血0.3 mL，置于加有抗凝劑的塑料離心管中，30 min后166×g離心10 min取血漿，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LC-MS/MS檢測條件

LC條件：色譜柱：Aglient Zorbax SB-C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：甲醇/0.1%甲酸水（50∶50）；流速：0.2 m L·min-1；柱溫：25℃；進樣量：5 μL。

MS/MS條件：ESI源，正離子多反應監(jiān)測模式：納曲酮（342.1→324.1），內標納洛酮（328.1→310.0），F(xiàn)ragmentor電壓135 V，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速12 L·min-1，毛細管電壓5 kV，Delta EMV為200 V。

1.5 標準曲線制備

精密稱取鹽酸納曲酮溶于甲醇，配成1 g·L-1（游離堿計）儲備液。該儲備液用甲醇/水（50∶50）分別稀釋成10，20，40，100，200，400，1000和2000 μg·L-1濃度系列的標準曲線工作液。精密稱取標準品鹽酸納洛酮適量，用甲醇溶解后得到1 g·L-1（游離堿計）內標儲備溶液，用甲醇/水（50∶50）稀釋成200 μg·L-1，作為內標溶液。取100 μL空白兔血漿，加入5 μL標準曲線工作溶液，得到濃度分別為0.5，1，2，5，10，20，50和100 μg·L-1的血漿標準曲線樣品。質控工作液（quality control，QC）同樣稀釋配制，納曲酮濃度分別為0.8，10和80 μg·L-1，定量限溶液配置為0.5 μg·L-1。

1.6 血漿樣品預處理

取兔血漿0.1 mL置于10 mL具塞玻璃試管中，加入5 μL甲醇/水（50∶50）（標準曲線樣品和質控樣品不加）、內標納洛酮（200 μg·L-1）5 μL、0.1 mol·L-1NaOH溶液10 μL，渦旋振蕩20 s后，加甲基叔丁基醚2 mL，渦旋振蕩2 min，于400×g離心10 min，分取有機層1.6 mL，在50℃條件下氮吹儀吹干。殘留物用流動相100 μL溶解，10 625×g離心10 min，分取上清75 μL，取 5 μL進樣。

1.7 統(tǒng)計學分析

血漿樣品預處理后經(jīng)LC-MS/MS檢測，所得的血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)PKS V1.0軟件（上海宏能軟件有限公司）處理，采用非房室模型計算主要藥動學參數(shù)。數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 質譜條件的確定和優(yōu)化

納曲酮和內標納洛酮在ESI正離子電離方式下，主要生成準分子離子峰［M+H］+峰，分別為m/z 342和m/z 328，選擇性對［M+H］+峰進行產(chǎn)物離子全掃描分析，納曲酮和內標納洛酮生成的主要碎片離子分別為m/z 324和m/z 310（圖2），將其作為定量分析監(jiān)測的產(chǎn)物離子，并進一步采用儀器自帶的二級優(yōu)化程序進行優(yōu)化，最終優(yōu)化碰撞能量分別為18 eV和20 eV。

Fig.2 Product ion spectra of［M+H］+of naltrexone（A）and naloxone（B）.

2.2 分析方法驗證

2.2.1 專屬性

在優(yōu)化后的LC-MS/MS條件下，空白血漿樣品、定量下限樣品（lower limit of quantification，LLOQ）和兔im給藥后的血漿樣品色譜圖見圖3。研究結果表明，納曲酮和內標納洛酮的保留時間分別為1.45和1.35 min，空白血漿中的內源性成分在目標成分的出峰位置無干擾。

2.2.2 標準曲線和定量下限

以每個待測物濃度為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值為縱坐標，采用1/x加權最小二乘法進行線性回歸，5 d內完成5條標準曲線的測定。平均標準曲線為y=（0.1987±0.0022）x+（0.0881± 0.0117）（n=5）。5條標準曲線在0.5～100 μg·L-1范圍內均顯示良好的線性（r2＞0.999）。新配LLOQ（0.5 μg·L-1）濃度點樣品進行定量下限的考察，每天測定5份樣品，連續(xù)3 d，計算批間和批內的準確度和精密度。在LLOQ濃度下，批間和批內準確度為109.5%和108.1%，RSD分別為3.2%和5.2%。

2.2.3 稀釋效應

對于超出線性范圍的血漿樣品，用空白血漿樣品稀釋10倍后進行重新測定，通過稀釋效應進行考察。配制800 μg·L-1的血漿樣品（n=3），用空白血漿稀釋10倍后，按1.6方法進行操作。根據(jù)隨行標曲計算樣品的實測濃度平均值為81.4 μg·L-1，準確度為101.8%，RSD為2.4%。表明采用空白血漿對高濃度樣品進行稀釋，對測定結果基本無影響。

2.2.4 基質效應和回收率

取0.8，10和80μg·L-13個濃度的質控樣品（n=6），按1.6方法進行操作，進行LC-MS/MS分析后所得的峰面積為A。取來源于不同兔的空白血漿0.1 mL，按1.6方法進行操作，殘留物分別用100 μL濃度分別為0.8，10和80 μg·L-1的納曲酮溶液（均含內標納洛酮10 μg·L-1）復溶，進行LC-MS/MS分析后所得的峰面積為B；取0.1×10-3L的水代替空白血漿，按1.6方法處理，所得的峰面積為C?；厥章剩?）=A/B×100%，基質效應（%）=B/C×100%。

Fig.3 Representative multiple reaction monitoring（MRM）chromatograms of naltrexone（A）and naloxone（B）in rabbit plasma.A1，B1 and C1：blank plasma sample；A2，B2 and C2：blank plasma spiked with 0.5 μg·L-1naltrexone and 10 μg·L-1 naloxone.Plasma sample collected after an im administration of naltrexone-3-O-caprylate.HPLC separation was accomplished on an Agilent Zorbax SB-C18 column（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）with a mobile phase composed of methanol-0.1 FA water（50∶50）at a flow rate of 0.2 mL·min-1.The ion transitions monitored in multiple reaction-monitoring modes were m/z 342.2→324.1 and m/z 328.1→310.2 for naltrexone and naloxone，respectively.

表1為基質效應和回收率的考察結果。在質控濃度為0.8，10和80 μg·L-1下，納曲酮的基質效應分別為87.2%，84.6%和86.8%，基質可引起目標成分信號抑制，但3個濃度的抑制程度基本相當，因此不影響目標成分的定量測定，內標納洛酮的基質效應為75.2%。3個濃度納曲酮的回收率分別為77.1%，81.0%和76.5%，內標納洛酮的回收率為77.8%。

Tab.1 Matrix effect and extraction recovery of naltrex?one and naloxone in rabbit plasma

2.2.5 準確度和精密度

采用3個分析批次對測定方法的準確度和精密度進行驗證，取濃度為0.8，10和80 μg·L-1的質控樣品，按1.6方法進行操作，在每個分析批次內進行5次分析測定，每分析批次隨行標準曲線，并以該標準曲線計算血藥濃度，求算每批的批內精密度和準確度以及3批共15個數(shù)據(jù)的批間精密度和準確度。方法的準確度和精密度結果如表2所示，3個濃度的質控樣品的準確度為94.9%～105.4%，批內精密度1.3%～5.0%，批間精密度2.7%～4.2%。分析方法的準確度和精密度均符合方法學要求。

2.2.6 穩(wěn)定性

方法學驗證過程中，利用0.8，10和80 μg·L-13個濃度的質控樣品對穩(wěn)定性進行考察，包括室溫25℃放置4 h、-20℃冷凍條件下保存30 d、樣品置于自動進樣器中8 h和3次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性，并利用隨行標準曲線計算樣品的實測濃度。樣品的穩(wěn)定性考察結果如表3所示，血漿樣品在室溫下放置4 h、-20℃保存30 d，處理后樣品在室溫條件下在自動進樣器內放置8 h以及血漿樣品3次凍融循環(huán)后樣品保持穩(wěn)定，準確度為98.3%～103.0%，精密度為1.8%～6.7%。

2.3 藥動學參數(shù)分析

應用所建立的LC-MS/MS方法測定了兔im給予納曲酮和納曲酮-3-O-辛酸酯后血漿中納曲酮的含量，平均血藥濃度-時間曲線見圖4。采用非房室模型對所測數(shù)據(jù)進行分析，得到主要的藥動力學參數(shù)見表4。研究結果表明，im給予納曲酮1.0 mg·kg-1后吸收迅速；而與之相比，im給予納曲酮-3-O-辛酸酯1.2 mg·kg-1后，血漿中納曲酮濃度上升緩慢，Tmax，T1/2和 MRTtn均顯著延長（P＜0.01），Cmax顯著降低（P＜0.01）。

Tab.2 Accuracy and precision of determination of naltrexone in rabbit plasma

Tab.3 Stability of naltrexone in rabbit plasma

Fig.4 Mean plasma concentration-time curve of naltrex?one after intramuscular administration of naltrexone（1 mg·kg-1）or equal molar dose of naltrexone-3-O-caprylate（1.2 mg·kg-1）in rabbits.

Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of naltrexone after intramuscular administration of naltrexone or naltrexone-3-O-caprylate in rabbits.

3 討論

本研究對LC-MS/MS方法學進行了系統(tǒng)驗證。采用ESI源進行正負離子掃描，發(fā)現(xiàn)納曲酮和內標納洛酮在正離子模式下響應值較高，因此采用正離子檢測模式。在色譜條件優(yōu)化中，以分離度、對稱性及保留時間為指標，對流動相組成及甲酸、乙酸、甲酸銨等添加劑的種類和含量進行優(yōu)化，最終確定以甲醇/0.1% FA水溶液（50∶50）作為流動相。在樣品預處理過程中，以回收率和基質效應為指標，考察了正己烷、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等有機溶劑及其不同比例的混合物作為提取溶劑，最后發(fā)現(xiàn)甲基叔丁基醚提取效率高，基質干擾少，最終優(yōu)選其為提取溶劑。本研究所建立的方法快速、準確、靈敏度高，適用于兔血漿樣品中納曲酮含量的測定。

兔是藥物臨床前研究的主要實驗對象之一。納曲酮及其新劑型常以兔為實驗對象開展代謝動力學研究［18-19］，同時也有一些文獻報道酯化前體藥物在兔體內的藥動學研究［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，納曲酮辛酸酯作為酯化前體藥物，能夠顯著延長納曲酮在體內的駐留時間，Tmax，T1/2和MRTtn都較納曲酮顯著延長，分別延長至35.8，7.4和9.3倍，Cmax降低至9.0%，起到明顯的緩釋效果。

本研究建立的LC-MS/MS方法可用于檢測兔血漿樣品中納曲酮的含量，并比較了納曲酮原型藥物與酯化前體藥物的藥動學參數(shù)，為設計研發(fā)阿片類毒品依賴者脫毒后長效抗復吸藥物提供數(shù)據(jù)參考。