劉 蘇，蔣秀云，陳 誠，汪正威，蔣興川*

(1.作物有害生物綜合治理安徽省重點實驗室，植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，合肥 230036；2. 安徽審計職業(yè)學(xué)院，合肥 230601；3. 中國科學(xué)院熱帶森林生態(tài)重點實驗室化學(xué)生態(tài)學(xué)組，中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，昆明 650000)

昆蟲的各項生命活動，如尋找配偶、定位寄主與產(chǎn)卵場所、躲避天敵等，都依賴于其靈敏的嗅覺系統(tǒng)(駱丹等, 2017; 盛子耀等, 2019)。昆蟲的嗅覺過程始于環(huán)境中的氣味化合物進入觸角上的嗅覺感器，這些氣味分子與感器中的載體蛋白和受體等互作，最終激活嗅覺神經(jīng)元，引導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生行為反應(yīng)(杜立嘯等, 2016; 劉偉等, 2018; 張玉等, 2019)。當(dāng)這一過程完成之后，感器中的氣味分子會被迅速降解，才能使嗅覺神經(jīng)元的敏感性恢復(fù)，以應(yīng)對新一輪的氣味刺激(Leal, 2013)。

與氣味降解相關(guān)的酶統(tǒng)稱為氣味降解酶(odorant-degrading enzymes, ODEs)，其包括多種代謝酶家族，如醛氧化酶(aldehyde oxidases, AOXs)、羧酸酯酶(carboxylesterases, CarEs)、細(xì)胞色素P450(cytochrome P450s, CYPs)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferases, GSTs)等(Younusetal., 2014)。醛類是多種鱗翅目昆蟲性信息素的主要組分，也是多種植物的主要揮發(fā)性成分，因此昆蟲觸角中的AOXs對于降解感器中的醛類氣味分子和維持嗅覺神經(jīng)元的敏感性具有重要作用(楊從文等, 2010; Chooetal., 2013; Xu and Liao, 2017)。

首個被鑒定的與氣味降解相關(guān)的AOX來自煙草天蛾Manducasexta(Rybczynskietal., 1989)。隨后的研究證實在家蠶Bombyxmori和多音天蠶Antheraeapolyphemus觸角中也存在多個能夠降解醛類(如苯甲醛benzaldehyde和蠶蛾醛bombykal)的AOXs(Rybczynskietal., 1990)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，編碼AOXs的基因也先后從家蠶、甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae、臍橙螟Amyeloistransitella等昆蟲中克隆得到(Merlinetal., 2005; Pelletieretal., 2007; Chooetal., 2013)。Choo等使用昆蟲細(xì)胞系表達了臍橙螟AtraAOX2，體外實驗證明重組的AtraAOX2蛋白能降解包括綠葉氣味反-2-己烯醛(trans-2-hexenal)和性信息素11Z，13Z-十六碳二烯醛(Z11Z13-16Ald)在內(nèi)的多種醛類(Chooetal., 2013)。通過對多種昆蟲的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行挖掘，大量的AOXs基因得以鑒定，其中有很多基因特異性或高量表達于昆蟲觸角，表明它們可能會參與醛類氣味物質(zhì)的降解(楊瑜等, 2010; Zhangetal., 2014; Huangetal., 2016; Xu and Liao, 2017; Zhangetal., 2017)。此外，還有一些AOXs主要表達于昆蟲的非嗅覺組織或幼蟲期。如致倦庫蚊Culexquinquefasciatus的一個AOX主要表達于高齡幼蟲，并與殺蟲劑抗性有關(guān)(Colemanetal., 2002)；家蠶絲腺中的一個AOX具有催化吲哚-3-乙醛(indole-3-acetaldehyde)生成吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid)的功能(Takeietal., 2019)。

大蠟螟Galleriamellonella屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyralidae蠟螟亞科Galleriinae，是危害養(yǎng)蜂業(yè)的重要害蟲之一(楊爽等, 2016)。大蠟螟成蟲在蜂巢中產(chǎn)卵，孵化的幼蟲蛀食巢脾，為害嚴(yán)重時，整箱巢脾被毀，導(dǎo)致群蜂飛逃(Kwadhaetal., 2017)。目前已被鑒定出的大蠟螟成蟲性信息素組分有3種，分別為壬醛(nonanal)、十一醛(undecanal)和5，11-二甲基二十五烷(5, 11-dimethylpentacosane)(Leyrer and Monroe, 1973; Svenssonetal., 2014)。大蠟螟成蟲對其中的壬醛和十一醛均有顯著的觸角電位反應(yīng)(Payne and Finn, 1977)，因此基于醛類揮發(fā)物的性信息素通訊對于大蠟螟至關(guān)重要?；诖耍深A(yù)測其觸角中應(yīng)當(dāng)存在能降解醛類物質(zhì)的AOXs。本研究通過檢索大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組，在鑒定了3個AOXs編碼基因(GmelAOX1、GmelAOX2和GmelAOX3)的基礎(chǔ)上，分析了這些基因的序列特征、基因組位置、外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以及組織表達模式。本研究結(jié)果以期為闡明大蠟螟AOXs的生理功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試蟲

大蠟螟幼蟲采集自安徽省合肥市郊區(qū)養(yǎng)蜂場(蜜蜂品種為意大利蜜蜂Apismellifera)。將幼蟲帶回實驗室，在人工氣候箱中飼養(yǎng)并建立實驗室種群。所用大蠟螟人工飼料的配方參考黃誠華等(2010)。飼養(yǎng)條件為：溫度27±1℃，相對濕度65%±5%，光 ∶暗周期14 h ∶10 h。

1.2 同源檢索與序列分析

基于Zhao等報道的大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組(Zhaoetal., 2019)，本研究使用BioEdit軟件中的TBLASTN程序在此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索AOXs編碼基因。所用的查詢模板為從GenBank中下載的鱗翅目昆蟲(如家蠶、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、大螟Sesamiainferens等)的AOXs蛋白序列，期望值(E-value)設(shè)為10-5。輸出結(jié)果經(jīng)BLASTX比對和手工檢查剔除冗余序列。

獲得大蠟螟GmelAOXs基因序列后，使用ORF Finder程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找其開放閱讀框(open reading frame, ORF)；使用ExPASy工具(www.expasy. org/tools/protparam.html)計算蛋白質(zhì)的理論分子量與等電點；使用NCBI的CD search(www.ncbi. nlm.nih.gov/structure/cdd/cdd.shtml)預(yù)測蛋白的保守功能域；根據(jù)已報道的大蠟螟基因組序列(Langeetal., 2018)，使用Splign程序(www. ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi)分析AOXs基因在基因組框架(scaffold)上的位置以及外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。使用Clustal Omega服務(wù)器(www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo)進行多序列連配，使用MEGA 7.0軟件以neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Kumaretal., 2016)，各分支置信度經(jīng)Bootstrap法重復(fù)檢驗1 000次。

1.3 總RNA提取與cDNA合成

收集羽化后48 h之內(nèi)未交配的大蠟螟雌、雄成蟲，解剖為不同組織：觸角、去除觸角的頭部、腹部和足。使用RNAiso Plus試劑(寶生物, 大連)提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000微量分光光度計分析樣品的質(zhì)量和濃度后，使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡, 日本)合成第一鏈cDNA。

1.4 組織表達模式分析

使用實時熒光定量PCR分析GmelAOXs在大蠟螟成蟲不同組織中的相對表達水平。所用引物見表1。在前期研究中發(fā)現(xiàn)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因在大蠟螟不同組織中的表達水平較穩(wěn)定，因此本實驗使用該基因作為內(nèi)參基因。在預(yù)實驗中，使用瓊脂糖凝膠電泳分析每對引物的擴增產(chǎn)物，并將產(chǎn)物送生物公司測序，以確定引物特異性。

定量PCR反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix(東洋紡,日本)、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、1 μL(10 ng)第一鏈cDNA和8 μL ddH2O。儀器為美國Bio-Rad公司CFX96型定量PCR儀，反應(yīng)程序為95℃ 2 min，1個循環(huán)；95℃ 10 s，60℃ 25 s，40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，溫度從60℃逐步升至95℃，繪制熔解曲線，以檢測是否存在引物二聚體。實驗設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，基因相對表達量使用2-△△Ct方法計算(Livak and Schmittgen, 2001)。使用DPS軟件9.5版進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(Tang and Zhang, 2013)，不同樣本之間的差異顯著性經(jīng)由單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey測驗進行比較。顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmelAOXs鑒定與序列分析

通過檢索大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組，獲得了3個編碼AOXs的cDNA序列，分別命名為GmelAOX1、GmelAOX2和GmelAOX3(GenBank登錄號分別為MT039791、MT039792和MT039793)。3個GmelAOXs的開放閱讀框介于3 798～3 870 bp之間，編碼的蛋白質(zhì)長度介于1 265～1 289個氨基酸之間(表2)。根據(jù)cDNA推導(dǎo)的3個GmelAOXs蛋白的分子量較為相似(139.5～144.2 kDa)，且等電點分別為6.1、6.0和6.4，均屬于酸性蛋白(表2)。BLASTX比對結(jié)果表明，3個GmelAOXs與同屬螟蛾科的亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis和臍橙螟的AOXs的氨基酸一致性最高(一致性67%～72%; 表2)。但3個GmelAOXs之間的氨基酸一致性較低，其中GmelAOX1與GmelAOX2的氨基酸一致性為46%，GmelAOX1與GmelAOX3的氨基酸一致性為52%，GmelAOX2與GmelAOX3的氨基酸一致性為45%。多序列比對結(jié)果表明，3個GmelAOXs蛋白序列中均含有相似的結(jié)構(gòu)域：2個鐵硫氧化還原中心(2Fe-2S)、8個保守的半胱氨酸殘基，1個黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合區(qū)域和1個鉬輔因子(MoCo cofactor)結(jié)合區(qū)域(圖1)。

表2 3個GmelAOXs的序列信息與BLASTX最佳匹配

圖1 大蠟螟3個GmelAOXs蛋白序列比對Fig.1 Alignment of the protein sequences of three GmelAOXs from Galleria mellonella注：2個鐵硫氧化還原中心([2Fe-2S] I和II)以灰色橫線表示，保守的半胱氨酸殘基以實心三角形標(biāo)注。黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合區(qū)域和鉬輔因子(MoCo cofactor)結(jié)合區(qū)域分別以虛線和點線表示。Note: Two iron-sulfur redox centers ([2Fe-2S] I and II)are indicated by the grey line, and conserved cysteine residues are indicated with solid triangles. The FAD-binding domain and the MoCo cofactor/substrate-binding domain are indicated by dashed and dotted lines, respectively.

2.2 系統(tǒng)進化分析

基于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目昆蟲和脊椎動物的AOXs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖2)。因AOXs與黃嘌呤脫氫酶(xanthine dehydrogenases, XDHs)具有較為相似的結(jié)構(gòu)域(Kurosakietal., 2013)，因此使用XDHs作為外群。結(jié)果清晰地顯示，昆蟲AOXs與脊椎動物AOXs以及脊椎動物和昆蟲的XDHs分別聚類在獨立的進化分支(圖2)。大蠟螟GmelAOXs與來自鱗翅目的AOXs親緣關(guān)系較近，GmelAOX1與棉鈴蟲HarmAOX2、大螟SinfAOX2、家蠶BmorAOX2和稻縱卷葉螟CmedAOX2聚為一支，GmelAOX2與臍橙螟AtraAOX2聚為一支，GmelAOX3與棉鈴蟲HarmAOX4和蘋果蠹蛾CpomAOX1聚為一支。此外，3個GmelAOXs被分隔在不同的進化分支上，暗示它們可能具有功能上的分化(圖2)。

圖2 不同物種AOXs進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of AOXs from various species注：3個GmelAOXs以實心三角表示。Three GmelAOXs are indicated with solid triangles. 物種、基因名稱與登錄號。Species, gene names and GenBank accession numbers: 家蠶Bombyx mori: BmorAOX1 (NP_001103812), BmorAOX2 (NP_001103811), BmorXDH1(BAA21640), BmorXDH2(BAA24290); 大螟Sesamia inferens: SinfAOX1(AII21996), SinfAOX2(AII21997), SinfAOX3(AII21998); 蘋果蠹蛾Cydia pomonella: CpomAOX1(AKQ06145), CpomAOX2(AKQ06146); 臍橙螟Amyelois transitella: AtraAOX2 (AGQ43599); 稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis: CmedAOX1(KY595778), CmedAOX2(KY595779), CmedAOX3(KY595780), CmedAOX4(KY595781); 小菜蛾P(guān)lutella xylostella: PxylAOX1(Px007526), PxylAOX2(Px003730), PxylAOX3(Px007519); 棉鈴蟲Helicoverpa armigera: HarmAOX1-HarmAOX6(Xu and Liao, 2017); 岡比亞按蚊Anopheles gambiae: AgamAOX(XP_316291), AgamXDH(AAO14865); 致倦庫蚊Culex quinquefasciatus: CquiAOX(AAF87601); 黑腹果蠅Drosophila melanogaster: DmelAOX1(AAF55207), DmelAOX2(AAF55208), DmelAOX3(AAF55209), DmelAOX4(AAF55210), DmelXDH(CAA68409); 赤擬谷盜Tribolium castaneum: TcasAOX1(XP_008190865), TcasAOX2(EFA11446), TcasAOX3(EFA13013); 小家鼠Mus musculus: MmusAOX1(NP_033806), MmusAOX2(NP_001008419), MmusAOX3(NP_076106), MmusAOX4(NP_076120), MmusXDH(NP_035853); 原雞Gallus gallus: GgalAOX1(DQ150102), GgalAOX2(DQ150103), GgalXDH(NP_990458).

2.3 基因結(jié)構(gòu)分析

使用Splign程序分析了GmelAOXs在大蠟螟基因組上的位置、長度和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，3個GmelAOXs位于不同的基因組框架(scaffold)上，其中GmelAOX1和GmelAOX3位于scaffold69，轉(zhuǎn)錄方向均為反向，序列間的距離為602 kb；而GmelAOX2位于scaffold96，轉(zhuǎn)錄方向為正向(圖3-A)。GmelAOX1、GmelAOX2和GmelAOX3在基因組上的長度分別為15 792 bp、22 970 bp 和27 237 bp。GmelAOX1和GmelAOX2分別含有17和16個外顯子，而GmelAOX2的外顯子數(shù)量較多，為21個(圖3-B)。

圖3 3個GmelAOXs基因在基因組上的分布(A)和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(B)Fig.3 Genomic locations (A)and exon-intron structures (B)of three GmelAOXs

2.4 組織表達模式分析

定量PCR結(jié)果表明，3個GmelAOXs基因在大蠟螟成蟲各組織中的表達模式不同。GmelAOX1主要表達于雌雄成蟲觸角和腹部，其在頭部和足部中的表達量顯著降低(P<0.05; 圖4-A)。GmelAOX2主要表達于雌雄成蟲觸角，其在觸角中的表達水平顯著高于其它組織(P<0.05; 圖4-B)。此外，GmelAOX2在雌雄觸角中的表達差異不顯著(P>0.05; 圖4-B)。GmelAOX3在雌雄觸角、腹部和足部均能檢測到較高的轉(zhuǎn)錄水平，而在頭部表達量顯著低于其它組織(P<0.05; 圖4-C)。

圖4 GmelAOXs基因在成蟲各組織中的相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of GmelAOX genes in various adult tissues注：A～C分別表示GmelAOX1、GmelAOX2和GmelAOX3。各基因在雌成蟲足部的表達量設(shè)為1倍。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: A～C represent GmelAOX1 to GmelAOX3, respectively. The expression level of each gene in female leg was set as one-fold. Different lowercase letters represent significant differences (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

作為一類重要的代謝酶，AOXs在動植物體內(nèi)廣泛存在。在植物中，AOXs相關(guān)研究多涉及植物生長素如脫落酸和吲哚乙酸的合成(Kasahara, 2016)；而在哺乳動物中，有關(guān)AOXs的研究主要集中于藥物與外源物代謝方面(Rom?oetal., 2017)。昆蟲的AOXs雖然也具有多種功能，但目前關(guān)注較多的是該基因在嗅覺過程中的作用。此前已有研究發(fā)現(xiàn)AOXs基因特異性表達于家蠶和甘藍(lán)夜蛾觸角上對性信息素敏感的毛型感器(Merlinetal., 2005; Pelletieretal., 2007)，并且煙草天蛾、多音天蠶和臍橙螟觸角中的AOXs蛋白能夠降解醛類性信息素和植物釋放的醛類揮發(fā)物(Rybczynskietal., 1989, 1990; Chooetal., 2013)。大蠟螟成蟲利用醛類性信息素進行種內(nèi)通訊(Leyrer and Monroe, 1973; Payne and Finn, 1977; Svenssonetal., 2014)，因此推測其觸角中應(yīng)當(dāng)也存在能夠降解醛類的AOXs。基于此假設(shè)，本研究從大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定了3個GmelAOXs基因。這些基因編碼的蛋白質(zhì)均具有醛氧化酶的典型特征，包括2個鐵硫氧化還原中心、1個FAD結(jié)合域和1個鉬輔因子結(jié)合域，這些特征與其它昆蟲AOXs蛋白一致(楊瑜等, 2010; Chooetal., 2013; Xu and Liao, 2017)。系統(tǒng)進化分析表明3個GmelAOXs均被劃分在AOX分支，且與其它鱗翅目昆蟲AOXs的親緣關(guān)系較近。這些結(jié)果證明了本研究鑒定的GmelAOXs均屬于醛氧化酶家族。

昆蟲AOX是一類多基因家族，在家蠶、棉鈴蟲和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的基因組中分別發(fā)現(xiàn)了8個、6個和4個AOXs基因(楊瑜等, 2010; Mareljaetal., 2014; Xu and Liao, 2017)。本研究從大蠟螟觸角中鑒定的GmelAOXs基因數(shù)量較少，可能是由于部分AOXs基因只表達于成蟲除觸角之外的其它組織，或是只表達于幼蟲期，因而無法從成蟲觸角中鑒定。如家蠶的8個AOXs基因中僅有2個(BmorAOX1和BmorAOX2)表達于成蟲觸角(楊瑜等, 2010)，棉鈴蟲HarmAOX5和HarmAOX6僅表達于幼蟲期或蛹期，而無法在成蟲期以及成蟲觸角中檢測到(Xu and Liao, 2017)。在其它鱗翅目昆蟲如大螟、蘋果蠹蛾Cydiapomonella、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis中，從觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定的AOXs數(shù)量也多在2～4個之間(Zhangetal., 2014; Huangetal., 2016; Heetal., 2017; Zhangetal., 2017)。另一方面，本研究僅是檢索大蠟螟觸角轉(zhuǎn)錄組，若對大蠟螟全基因組進行數(shù)據(jù)挖掘?qū)@得更加全面的AOXs基因家族信息。此外，本研究發(fā)現(xiàn)3個GmelAOXs基因均由數(shù)量眾多的外顯子(16～21個)組成，這與棉鈴蟲AOXs基因家族(16～21個外顯子)一致(Xu and Liao, 2017)，而與家蠶AOXs家族的外顯子數(shù)量(12～20個)略有差異(楊瑜等, 2010)。雖然目前尚無關(guān)于昆蟲AOXs基因可變剪切的報道，但在脊椎動物如小家鼠Musmusculus中已發(fā)現(xiàn)AOXs基因存在可變剪切的現(xiàn)象，但這一現(xiàn)象的生物學(xué)意義仍不明確(Kurosakietal., 2004)。因此，明確大蠟螟GmelAOXs的基因組信息與外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)將有助于深入探究該基因家族在昆蟲中的進化與分化。

研究AOXs在不同組織中的表達模式有助于推測基因的功能。本研究發(fā)現(xiàn)GmelAOX2在大蠟螟雌雄成蟲觸角中均高量表達，且表達水平顯著高于其它非嗅覺組織如頭部、腹部和足部。大蠟螟性信息素中含有揮發(fā)性醛類組分(Svenssonetal., 2014)，因此推測GmelAOX2編碼的蛋白可能在降解進入觸角感器的醛類揮發(fā)物過程中起作用。本研究雖沒有驗證GmelAOX2蛋白對醛類物質(zhì)的降解功能，但GmelAOX2與臍橙螟AtraAOX2的氨基酸一致性較高(表2)，而AtraAOX2重組蛋白可降解包括性信息素和植物揮發(fā)物在內(nèi)的多種醛類底物(Chooetal., 2013)，這為推測GmelAOX2的潛在功能提供了參考。GmelAOX1高量表達于雌雄成蟲觸角和腹部，GmelAOX3大量表達于除頭部之外的所有組織，暗示這些基因可能具有雙重功能，即降解進入觸角感器中的醛類氣味分子和清除進入體內(nèi)的外源醛類物質(zhì)。在其它昆蟲如稻縱卷葉螟和棉鈴蟲中，也發(fā)現(xiàn)了多個AOXs基因同時高量表達于觸角和非嗅覺組織(Xu and Liao, 2017; Zhangetal., 2017)。需要說明的是，本實驗僅分析了GmelAOXs基因在大蠟螟成蟲組織中的表達模式，沒有檢測這些基因在幼蟲代謝器官(如中腸、馬氏管和脂肪體等)中的表達情況，因此這些基因在大蠟螟幼蟲生理過程中的功能暫不明確。后續(xù)研究將使用嗅覺感器定位、真核表達、酶活測定以及RNA干擾等技術(shù)，闡明大蠟螟AOXs在嗅覺和其它生理過程中的功能。