王 盈

（中國鐵路哈爾濱局集團(tuán)有限公司 哈爾濱鐵路疾病預(yù)防控制中心海拉爾分中心，內(nèi)蒙古 海拉爾021000）

沙門氏菌是一種常見的引起人類、動(dòng)物發(fā)病及食物中毒的食源性致病菌之一，極易污染水源、食品等，對人類健康造成危害，在食品檢測中具有重要意義[1-2]。此次能力驗(yàn)證由市場監(jiān)督管理局監(jiān)管、食品檢驗(yàn)檢測中心承擔(dān)，是考核實(shí)驗(yàn)室能力的一次檢測，此次的能力驗(yàn)證不僅是對檢測人員的考察，對促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)問題、提高檢驗(yàn)檢測水平也有積極意義[3-4]，針對考核情況進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品編號為SLM9-19010 和SLM9-19016，為2 個(gè)西林瓶密封的質(zhì)控球，由某食品檢驗(yàn)檢測中心提供。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器

緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、三糖鐵(TSI)瓊脂、蛋白胨水靛基質(zhì)試劑、尿素瓊脂、氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒，均購置于北京某公司。所有培養(yǎng)基及試劑均驗(yàn)證合格并在有效期內(nèi)。

采用恒溫恒濕培養(yǎng)箱(BSC-250，36℃)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-420，42℃)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(BXM-30R)。

1.3 方法

根據(jù)組織方要求，樣品前處理應(yīng)按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行，后續(xù)檢測依據(jù)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》(GB 4789.4—2016)[5]進(jìn)行。

1.3.1 樣品前處理

檢測前，先將未開啟的質(zhì)控球置于室溫條件下，待恢復(fù)至室溫后(約15 min)，無菌操作打開編號SLM9-19010 和SLM9-19016 西林瓶的鋁塑蓋和膠塞，用25 mL 無菌生理鹽水完全溶解質(zhì)控樣品，振蕩混勻。待溶解后，吸出放入無菌瓶中，反復(fù)用稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中。此溶液即為待測樣品溶液，記為SLM9-19010 待測樣品溶液和SLM9-19016待測樣品溶液。

1.3.2 預(yù)增菌和增菌

將SLM9-19010和SLM9-19016待測樣品溶液分別轉(zhuǎn)移至盛有225 mL滅菌的BPW均質(zhì)袋中，振蕩混勻，于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h；預(yù)增菌后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，分別吸取1 mL預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種于10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液中，TTB混合增菌液于42℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，SC混合增菌液于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；10 mL TTB增菌液和10 mL SC增菌液做空白對照。

1.3.3 分離培養(yǎng)

用直徑3 mm的無菌接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于BS瓊脂、XLD瓊脂、HE瓊脂和沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板；BS瓊脂在36℃下培養(yǎng)48 h，XLD瓊脂、HE 瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板在36℃下培養(yǎng)24 h，并做空白對照，培養(yǎng)結(jié)束后觀察菌落生長情況。

1.3.4 生化鑒定

在HE瓊脂、XLD瓊脂、沙門氏菌顯色、BS瓊脂平板上挑取可疑菌落，分別接種在三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺，接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)管、對照管各1 支同時(shí)接種蛋白胨水、尿素、KCN 培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂平板于36℃培養(yǎng)24 h；為確保生化鑒定結(jié)果，同時(shí)采用沙門氏菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定，根據(jù)試劑盒說明書從新鮮培養(yǎng)的單個(gè)純菌落用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)木鷳乙?，同時(shí)接種于三糖鐵生化管，24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性平板分離

將增菌液劃線與多個(gè)平板進(jìn)行劃線培養(yǎng)，2 份樣品SLM9-19010和SLM9-19016在各平板上的菌落形態(tài)如表1所示。

表1 選擇平板上的菌落形態(tài)

2.2 菌落的生化反應(yīng)

樣品SLM9-19010在各個(gè)平板上都沒有典型菌落。樣品SLM9-19016 在各個(gè)平板上都有典型菌落。挑取SLM9-19016 中2 個(gè)HE 瓊脂平板藍(lán)綠色中心帶黑色菌落(編號分別為SLM9-19016-1，SLM9-19016-2)，2 個(gè)XLD瓊脂平板黑色菌落(編號分別為SLM9-19016-3和SLM9-19016-4)，2 個(gè)沙門顯色培養(yǎng)基淡紫色菌落(編號分別為SLM9-19016-5和SLM9-19016-6)，2個(gè)BS瓊脂平板黑色帶金屬光澤菌落(編號分別為SLM9-19016-7和SLM9-19016-8)進(jìn)行生化鑒定，以上菌落經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂平板純化培養(yǎng)后，再進(jìn)行沙門氏菌生化鑒定試劑盒鑒定，結(jié)果如表2所示。

表2 SLM9-19016生化反應(yīng)結(jié)果

根據(jù)生化鑒定結(jié)果SLM9-19016-1到SLM9-19016-8都為同一種菌，并且為沙門氏菌屬；SLM9-19010 未檢出沙門氏菌。

3 結(jié)論與討論

3.1 檢測結(jié)果

本次能力驗(yàn)證通過預(yù)增菌和選擇性增菌后，用HE瓊脂、XLD瓊脂、沙門氏菌顯色、BS瓊脂平板進(jìn)行篩選，平板上均出現(xiàn)可疑沙門氏菌，尤其在沙門顯色培養(yǎng)基中出現(xiàn)了典型菌落，經(jīng)分離純化后進(jìn)行生化試劑盒鑒定，鑒定出SLM9-19010 未檢出沙門氏菌，SLM9-19016檢出沙門氏菌屬。

3.2 分析討論

（1）樣品分離。在打開樣品進(jìn)行初步分離時(shí)，必須按照要求操作，在室溫放置一段時(shí)間，同時(shí)增菌液的次數(shù)按要求加入且反復(fù)吹打，盡量使西林瓶內(nèi)的所有細(xì)菌都洗脫出來，如果樣品中所含細(xì)菌量少，不按此步驟易造成細(xì)菌漏檢。

（2）避免交叉污染。在實(shí)驗(yàn)過程中最好使用帶濾芯的槍頭以防吸液時(shí)樣液沖入移液器而污染其他樣品。在樣品開啟前、預(yù)增菌和增菌、接種TTB增菌液和SC增菌液、劃線分離過程中每個(gè)樣品應(yīng)獨(dú)立進(jìn)行，防止樣品之間交叉污染和樣品混淆。

（3）培養(yǎng)基選擇。本次按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，沙門氏菌的選擇性分離培養(yǎng)尤為重要，因其在不同的培養(yǎng)基上生長狀態(tài)不一，BS瓊脂培養(yǎng)基需要培養(yǎng)48 h；沙門顯色培養(yǎng)基屬于強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基，沙門菌屬在此培養(yǎng)基的菌落易識別。檢測采用了BS瓊脂、HE瓊脂、XLD瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基，多種培養(yǎng)基可以相互佐證以給予更好的證據(jù)支持。

（4）平板分區(qū)劃線。在平板進(jìn)行細(xì)菌分離中，劃線培養(yǎng)是很重要的一步，在分區(qū)劃線時(shí)，應(yīng)進(jìn)行多區(qū)劃線，避免菌落出現(xiàn)彌漫性生長，從而不好挑取單個(gè)純種菌落進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行生化鑒定時(shí)，選用多個(gè)特征性菌落可以避免漏篩，生化鑒定應(yīng)選擇品質(zhì)較好的試劑且需把控質(zhì)量。

（5）生物安全。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意生物安全，避免操作人員被感染，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對培養(yǎng)物盡快進(jìn)行無害化處理，避免污染環(huán)境。

4 結(jié)束語

參加能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室保持技術(shù)能力的一種有效方式，此次對乳粉中沙門氏菌的檢驗(yàn)，考察檢驗(yàn)人員技術(shù)能力，使實(shí)驗(yàn)室可以發(fā)現(xiàn)問題、及時(shí)改進(jìn)糾正，確保檢驗(yàn)檢測達(dá)到質(zhì)量要求。