田鳳鳴,陳 強(qiáng),何九軍,卓平清

( 1.隴南師范高等?？茖W(xué)校 農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 隴南 742500;2.隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅 隴南 742500)

由腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani(Mart)Sscc.)引起[1]的花椒根腐病會導(dǎo)致根系的腐爛，葉片變小、枝條發(fā)育不全，最終導(dǎo)致全株枯死，嚴(yán)重影響到花椒產(chǎn)量和品質(zhì)，給隴南的花椒經(jīng)濟(jì)造成了巨大的損失.

木霉菌在植物病害防治中具有非常重要的作用，是一種資源非常富有的拮抗微生物，目前研究中發(fā)現(xiàn)，木霉至少對18個屬29種病原真菌具有很好拮抗作用[2].在抗生作用中，木霉對病原菌的拮抗是通過產(chǎn)生有害的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行的，例如一些酶類和抗生素[3].木霉菌可以防治多種植物的病害，如玉米紋枯病、甜瓜根腐病[4].但對防治隴南花椒根腐病的報道很少，本文為再次明確綠色木霉和哈茨木霉對花椒根腐病的拮抗作用，擬通過平板對峙培養(yǎng)實(shí)驗、木霉發(fā)酵液的抑菌活性的檢測，研究兩種木霉菌對引起花椒根腐病主要病原菌茄腐鐮孢菌的拮抗效果，為進(jìn)一步開發(fā)復(fù)合木霉菌制劑防治花椒根腐病提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

由本實(shí)驗室從隴南武都區(qū)花椒種植基地采樣，從典型的花椒根腐病病株中分離獲得，通過致病性實(shí)驗和分子檢測結(jié)果顯示：隴南花椒根腐病的主要致病菌為茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)，將分離獲得的病原菌保存于4℃冰箱，拮抗試驗時接種于PDA培養(yǎng)基中活化使用.綠色木霉和哈茨木霉分別由隴南師專微生物實(shí)驗室提供.

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基的制備：去皮的馬鈴薯200 g，馬鈴薯切小塊沸水中煮30 min，四層紗布過濾，濾液中依次加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g～20 g，定容至1000 mL，分裝后高壓滅菌21 min后倒平板.

1.2 試驗方法

1.2.1 平板對峙法

以本實(shí)驗分離獲得的隴南花椒根腐病病原菌茄腐鐮孢菌為指示菌，用6 mm的打孔器將指示菌打成菌餅接種在PDA培養(yǎng)基的中央，將兩種木霉菌和復(fù)配后的木霉菌分別等距離接種在病原菌的四周，點(diǎn)接處距離病原中心2 cm，培養(yǎng)5 d后計算木霉菌對病原菌的抑制率.

抑制率=(對照病原菌的直徑-處理組病原菌直徑)/對照組病原菌直徑×100%.

1.2.2 木霉菌對病原菌前端菌絲的影響

將1.2.1中的試驗平板放置于體視顯微鏡(放大倍數(shù)為7X-180X)下，觀察單一木霉菌和復(fù)配木霉菌對病原菌前端菌絲的影響.

1.2.3 木霉菌的對花椒根片和根部的離體拮抗實(shí)驗

木霉菌和病原菌孢子液的制備：將病原菌和木霉菌分別接種在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d～5 d，加入適量的無菌水沖洗提前培養(yǎng)好的孢子并對其進(jìn)行過濾，制成1.0×106個/mL濃度的孢子液.

木霉復(fù)配孢子液的制備：將綠色木霉和哈茨木霉按照1∶1的比例混合，制成復(fù)配孢子液濃度為：1.0×106個/mL.

花椒主根根片的離體拮抗實(shí)驗：取新鮮花椒主根經(jīng)75%的酒精消毒后，用無菌單面刀片切成3 mm～5 mm的薄片，在無菌水中漂洗至少3次，按照品字形放置于提前鋪好無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，為保持濕度，提前在培養(yǎng)皿的濾紙中加入8 mL的無菌水，分別在根片中接入100 μL的綠色木霉孢子液、100 μL的哈茨木霉孢子液培養(yǎng)、100 μL的木霉復(fù)配孢子液，然后再接入100 μL的病原菌孢子液，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，觀察木霉菌對花椒根腐病病原菌的拮抗作用.

花椒根部側(cè)根的離體拮抗實(shí)驗：取大小相似的新鮮花椒側(cè)根，經(jīng)75%的酒精消毒后，在無菌水中漂洗至少3次，用無菌濾紙吸干側(cè)根部位的水分，(每培養(yǎng)皿側(cè)根數(shù)目為5)放置于提前鋪好無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，為保持濕度，提前在培養(yǎng)皿的濾紙中加入8 mL的無菌水，分別在根片中接入100 μL的綠色木霉孢子液、100 μL的哈茨木霉孢子液培養(yǎng)、100 μL的木霉復(fù)配孢子液，然后再接入100 μL的病原菌孢子液，28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，觀察木霉菌對花椒根腐病病原菌的拮抗作用.

1.2.4 復(fù)配木霉菌無菌發(fā)酵濾液抑菌活性的穩(wěn)定性

復(fù)配無菌發(fā)酵液的制備：分別將綠色木霉和哈茨木霉接種于液體PDA培養(yǎng)基中，在28℃ 150 rpm/min 培養(yǎng)7 d后，收集發(fā)酵液，發(fā)酵液用0.22 μm 無菌濾膜過濾，再將2種木霉的發(fā)酵液按照體積比1∶1混合，存于4℃冰箱備用.

復(fù)配發(fā)酵液對病原菌的抑制作用：將10 mL 復(fù)配發(fā)酵濾液與40 mL PDA 培養(yǎng)基(冷卻至60℃)混合均勻后倒平板，將打孔器打成的6 mm的病原菌菌餅接種于平板中央，以無菌水(10 mL )與 PDA(40 mL)培養(yǎng)基混合均勻倒平板為對照. 在28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算復(fù)配木霉發(fā)酵液對花椒根腐病病原菌菌絲的抑制，每種條件下的試驗重復(fù)3次.

(i)pH對復(fù)配木霉菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

為了檢測復(fù)配發(fā)酵液對pH的穩(wěn)定性，本次試驗中將木霉菌的復(fù)配發(fā)酵液的pH值分別調(diào)至1、3、5、7、9、11、13七個不同的梯度，以初始pH=6.8為空白對照組，再按照1.2.4中復(fù)配發(fā)酵液對病原菌的抑制作用的方法進(jìn)行最適pH的研究.

(ii)溫度對復(fù)配木霉菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

為了檢測復(fù)配發(fā)酵液對溫度的穩(wěn)定性，本次試驗中將木霉菌的復(fù)配發(fā)酵液的溫度分別設(shè)置至0、20、40、60、80、100℃六個不同的梯度，分別處理30 min，室溫平衡10 min，再按照1.2.4中復(fù)配發(fā)酵液對病原菌的抑制作用的方法進(jìn)行最適溫度的研究，每個處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果

2.1 病原菌和木霉菌的活化

將備用的花椒根腐病病原菌茄腐鐮孢菌、哈茨木霉、綠色木霉接種于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 d～5 d后備用. 腐鐮孢菌(見圖1(a),哈茨木霉(見圖1(b),綠色木霉(見圖1(c).

圖1 病原菌和木霉菌

2.2 木霉菌對病原菌的拮抗效果

按照1.2.1中的平板對峙法研究了木霉菌對病原菌菌絲抑制的影響，實(shí)驗結(jié)果表明：哈茨木霉和綠色木霉單獨(dú)使用均對花椒病原菌的生長有抑制作用，培養(yǎng)5 d后，對照病原菌菌落直徑可達(dá)60 mm(見圖2(a))，有綠色木霉拮抗菌的病原菌直徑為22 mm(見圖2(b))，抑制率可達(dá)63%；有哈茨木霉拮抗菌的病原菌直徑為20 mm(見圖2(c)),抑制率可達(dá)67%； 有木霉(哈茨木霉∶綠色木霉以1∶1復(fù)配)拮抗菌的病原菌直徑為7 mm，抑制率可達(dá)88%.此試驗結(jié)果說明：復(fù)配后的木霉菌抑菌效果顯著優(yōu)于單一木霉菌的抑菌效果.

圖2 木霉菌對病原菌的拮抗效果

2.3木霉菌對病原菌前端菌絲生長的影響

顯微鏡下觀察了木霉菌對病原菌前端菌絲生長的影響：對照病原菌的菌絲前端菌絲生長粗細(xì)均勻，濃密，蓬松，無扭曲變形，延伸性好，呈放射狀(圖3(a))；接種了單一和復(fù)配木霉拮抗菌的病原菌菌絲的生長都不同程度地受到限制， 由圖3(b)、3(c)、3(d)可知：木霉菌的菌絲纏繞在病原菌茄腐鐮孢菌的菌絲上，使得病原菌菌絲失去很好的延伸性，扭曲變形，粗細(xì)不均勻，菌絲變的稀薄且變短，彎曲生長，后期木霉菌直接可在病原菌菌落中生長，逐漸將病原菌消除瓦解，病原菌菌絲生長的受限可能與木霉代謝產(chǎn)物中的有害物質(zhì)有關(guān)，復(fù)配木霉菌對病原菌菌絲生長的抑制程度顯著高于單一木霉菌.

圖3 木霉菌對病原菌前端菌絲的抑制效果

2.4 木霉菌對花椒主根根片的離體拮抗實(shí)驗

為進(jìn)一步明確復(fù)配木霉菌的拮抗效果優(yōu)于單一木霉菌的拮抗效果，本試驗進(jìn)行了花椒主根根片的離體回接，實(shí)驗結(jié)果表明：接種無菌水的主根根片保持原有的色澤，根皮與木質(zhì)部未發(fā)生分離，無任何的氣味，也無液體流出(圖4(a))，接種了病原菌的根片顏色發(fā)黑，根皮與木質(zhì)部分離，周圍流出棕褐色液體，有股異臭味，木質(zhì)部變軟易分離(圖4(a))，接種了單一木霉菌和復(fù)配木霉菌的根片也有不同程度的發(fā)病，接種了單一木霉菌的根片發(fā)病顏色呈深褐色，也伴有異臭味，根皮和木質(zhì)部分離(見圖4(c)、4(d))，但接種了復(fù)配木霉菌的根片顏色明顯較淺，根皮和木質(zhì)部未發(fā)生完全的分離，木質(zhì)部依然保持堅硬不易分離.離體回接試驗說明復(fù)配木霉菌的防治效果優(yōu)于單一木霉菌.

2.5 木霉菌對花椒側(cè)根的離體拮抗實(shí)驗

為再次明確復(fù)配木霉菌在花椒根腐病病原菌中的防治效果，將單一木霉菌和復(fù)配木霉菌接入花椒側(cè)根進(jìn)行離體試驗，結(jié)果說明(圖5可知)：有復(fù)配木霉菌存在的發(fā)病的花椒側(cè)根顏色明顯比有單一木霉菌存在的發(fā)病的花椒側(cè)根顏色較淺，而接種了病原菌的花椒側(cè)根3 d后就開始發(fā)病，根部變黑變軟、接種了木霉菌的側(cè)根會延遲發(fā)病或是不發(fā)病，本離體實(shí)驗為后期復(fù)配木霉菌在花椒根腐病上的防治應(yīng)用提供了可靠的基礎(chǔ).

圖5 木霉菌對花椒側(cè)根侵染病原菌的拮抗作用

2.6 復(fù)配木霉菌無菌發(fā)酵濾液抑菌活性的穩(wěn)定性

2.6.1 pH值對復(fù)配木霉菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖6可知，偏酸偏堿環(huán)境對復(fù)配木霉發(fā)酵液的抑菌活性都有影響，在pH為7時抑菌活性達(dá)到最高，可達(dá)69%.

圖6 pH值對復(fù)配木霉發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.6.2 溫度對復(fù)配木霉菌無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖7可知，經(jīng)不同梯度的溫度檢測，復(fù)配木霉無菌發(fā)酵液對熱穩(wěn)定性較差，高于40℃的溫度不利于發(fā)酵液產(chǎn)生較好的活性，在20 ℃～40 ℃之間此發(fā)酵液均具有良好的抑菌活性，抑菌率可達(dá)67%.

圖7 溫度對復(fù)配木霉發(fā)酵液抑菌活性的影響

3 結(jié)論

植物病害的真菌生防制劑中木霉生防制劑在防治中占60%以上[5]，處理種子、處理土壤、噴施葉片等方面被廣泛應(yīng)用[6].

木霉菌在植物病蟲害的防治中，病原菌的生長受木霉菌的抑制，同時木霉菌有利于植物生長，還能在化學(xué)農(nóng)藥方面減少使用，這樣生態(tài)環(huán)境更有利于受到保護(hù).

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，2種以上的機(jī)制同時或順序作用才會使木霉菌產(chǎn)生良好的拮抗作用[7].木霉菌的協(xié)同增效能力是基于多機(jī)制性的結(jié)果.哈茨木霉菌與殺菌劑協(xié)同使用時的抑制率大于兩者單獨(dú)使用，能夠很好地抑制番茄灰霉病[8]；在張婧迪等[9]研究中，發(fā)酵代謝物(深綠木霉菌CCTCC-SWB0199)按照一定比例與蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配，在番茄灰霉病中的防治效果優(yōu)于二者單獨(dú)使用.

本文通過平板對峙實(shí)驗、菌絲前端形態(tài)的觀察實(shí)驗、花椒主根和側(cè)根的離體回接實(shí)驗再次明確了哈茨木霉和綠色木霉對花椒根腐病病原菌的拮抗作用，單一菌株的接種和復(fù)配菌株的接種實(shí)驗說明：復(fù)配木霉菌株的拮抗效果顯著高于單一菌株的拮抗效果，復(fù)配菌株接種后，抑制率可達(dá)88%.

復(fù)配木霉菌株對根腐病病原菌的前端菌絲具有很好的抑制作用，幾乎完全抑制了病原菌菌絲的延伸，這與木霉有著極強(qiáng)的適應(yīng)性相關(guān)，木霉在生長方面競爭性優(yōu)于病原菌，通過競爭根際的空間和養(yǎng)分，從而削弱病原菌的生長，此結(jié)論與本實(shí)驗結(jié)果相一致[10].在離體回接實(shí)驗中復(fù)配木霉菌株也表現(xiàn)出了良好的拮抗作用，接種了復(fù)配菌株的主根根片和側(cè)根的發(fā)病癥狀相對于接種病原菌的根片和側(cè)根無論在色澤、氣味、堅硬程度、根皮與木質(zhì)部的分離狀態(tài)等方面都有所緩減，此試驗結(jié)果為后期花椒根腐病在大田中的防治提供了很好的理論基礎(chǔ).

后期又對復(fù)配木霉發(fā)酵液的穩(wěn)定性作了檢測，實(shí)驗結(jié)果表明：發(fā)酵液在pH為7、溫度在20 ℃～40 ℃的范圍內(nèi)表現(xiàn)出很好的抑菌活性，抑制率分表可達(dá)：69%和67%.盡管發(fā)酵液在一定的條件下具有很好的穩(wěn)定性，但其抑菌活性不及接種復(fù)配木霉菌時的抑菌活性，此實(shí)驗結(jié)果可能與發(fā)酵液的濃度有關(guān)，在后續(xù)的實(shí)驗中會對如何提高發(fā)酵液的濃度做進(jìn)一步的研究.本實(shí)驗僅僅在實(shí)驗室中進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗，后續(xù)會將其應(yīng)用于大田中，為后期花椒根腐病的有害防治奠定重要的基礎(chǔ).