李楠 姜黎黎 寸建萍 周曉芳 曹億會 楊溪 田炳均

云南省疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防制所，昆明650022

手足口病是一種由多種腸道病毒（EV）引起的，主要累及兒童特別是5 歲以下嬰幼兒。 它雖是一種自限性疾病，但是重癥患兒可出現(xiàn)腦干腦炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重的可致死亡[1]。 腸道病毒71型（EV-A71）和柯薩奇病毒A16 型（CV-A16）被認(rèn)為是手足口病的主要病原[2]。 自2012 年開始出現(xiàn)相關(guān)報道后CV-A6 已經(jīng)逐漸成為中國大陸手足口病傳播的重要病原，近幾年在一些地區(qū)CV-A6 已經(jīng)取代EV-71 和CV-A16 成為手足口病暴發(fā)流行的主要病原[3]。 本研究探討了2016—2018 年昆明市手足口病病原構(gòu)成情況， 并對分離到的57 株CV-A6 毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析以闡明昆明市流行的CV-A6 基因特征。

對象與方法

一、 研究對象

本研究中的病例信息來源于中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)——傳染病報告信息管理系統(tǒng)。 收集2016—2018 年從云南省手足口病實驗室監(jiān)測系統(tǒng)采集到的2 935 份昆明市手足口病患兒的樣本，大部分為糞便樣本，少部分為咽拭子和肛拭子。 采集樣本前告知采樣對象或監(jiān)護(hù)人員采樣目的并發(fā)放知情同意書并簽字。

二、儀器和試劑

儀器包括美國ABI 公司PCR 儀Veriti 96 Well Termal Cycler， 美國Bio-Rad 公司實時熒光定量PCR 儀CFX96。試劑包括美國Promega 公司Access Quick 試劑盒 （批號：A1250）， 德國QIAGEN 公司QIAamp Viral RNA Mini Kit（批號：1020953），江蘇碩世生物科技公司CV-A16 型和EV-A71 型+EV 通用型核酸檢測試劑盒（批號：20191001）。

三、研究方法

參照《手足口病實驗室手冊（第4 版）》[4]對收集到的患兒樣本進(jìn)行處理后，接種于人類橫紋肌肉瘤（RD）細(xì)胞和人喉癌上皮（Hep-2）細(xì)胞（細(xì)胞來自中國CDC 病毒病預(yù)防控制所脊髓灰質(zhì)炎實驗室）進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。 分離到的毒株使用德國QIAGEN 公司的病毒RNA 提取試劑盒提取病毒核酸， 以提取的病毒RNA 為模板， 用CV-A16 型和EV-A71 型+EV 通用型核酸檢測試劑盒 （江蘇碩世生物科技公司）進(jìn)行實時熒光RT-PCR 檢測，并對非EV-A71 和非CV-A16 陽性樣本進(jìn)行普通RT-PCR 擴增得到VP1 全長序列，對CV-A6 病毒進(jìn)行基因進(jìn)化分析。

四、病毒分型鑒定

以非EV-A71 和非CV-A16 的陽性樣本提取的病毒RNA 為模板，使用美國Promega 公司的Access Quick RT-PCR 試劑盒和A、B 和C 組腸道病毒特異性引物[5]，對毒株VP1 區(qū)基因進(jìn)行分段擴增、拼接和組裝，得到CV-A6 全長VP1 編碼區(qū)。 擴增條件：50 ℃30 min，95 ℃15 min；94 ℃30 s，45℃30 s，68 ℃50 s，40 個循環(huán)；68 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司（上海）雙向測序。 測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行Blast 搜索初步定型，使用MEGA5.2 軟件分析，依據(jù)Oberste 等[6]的理論判定病毒型別。

五、CV-A6 序列分析

從GenBank 下載文獻(xiàn)[7-8]中所用的來自法國、日本、美國、芬蘭、中國臺灣及中國大陸的山東、上海、河南、廣東、云南、浙江和吉林等12 個?。ㄊ校┚哂写硇缘?2 條CV-A6 VP1 區(qū)全長序列。 用MEGA 5.2 的臨位連接法（NJ）和Kimura-2 參數(shù)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過可靠性Bootstrap=1 000 進(jìn)行評估。 以核苷酸平均差異＞15%劃分基因型別[8-10]。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

用Excel 錄入和導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 采用描述性流行病學(xué)方法分析手足口病流行特征及病原構(gòu)成變化。

結(jié) 果

一、昆明市手足口病流行概況

2016 年昆明市報告手足口病20 197 例， 發(fā)病率302.49/10 萬；2017 年昆明市報告14 357 例，發(fā)病率213.39/10 萬；2018 年昆明市報告23 884 例，發(fā)病率352.12/10 萬。 昆明市手足口病連續(xù)3 年病例數(shù)及發(fā)病率居云南省前5 位，并呈隔年高發(fā)的特點。 每年6 月均為發(fā)病高峰，此后發(fā)病水平逐漸下降，第二個流行高峰出現(xiàn)在12 月（見圖1）。

圖1 2016—2018 年昆明市手足口病按月發(fā)病情況

二、手足口病病原分布

2016—2018 年云南省手足口病實驗室監(jiān)測系統(tǒng)中共采集到的昆明市手足口病患兒樣本2 935份， 實驗室診斷陽性2 318 份， 陽性率78.98%。2016、2017 和2018 年檢出手足口病病原的陽性率分別為84.35%（776/920）、79.21%（785/991）和73.93%（757/1 024），病原構(gòu)成中EV-A71 占比逐年減少，CV-A16 所占比例隔年增高。 除2016 年CVA16 為優(yōu)勢病原， 其余年份均為其他EV，3 年間分離到CV-A6 共計57 株。 詳見表1。

表1 2016—2018 年昆明市手足口病病原分布[株（%）]

三、CV-A6 昆明株基因進(jìn)化分析

57 株昆明市CV-A6 毒株的VP1 區(qū)全長序列與32 條參考序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。 結(jié)果表明，2016—2017 年昆明市57 株CV-A6 與D3a 流行株親緣性最近。昆明市CV-A6 毒株分為2 個進(jìn)化分支（cluster），分支2 包含1 株昆明市2017 年的CV-A6和浙江、吉林、法國等地的6 條CV-A6 序列，cluster1則包含其余56 株昆明市CV-A6 和昆明市2014、2015 年以及中國大陸不同省份和中國臺灣的8 條代表株。

57 株昆明市CV-A6 毒株序列之間核苷酸一致性為91.69%～100.00%， 氨基酸同源性為96.39%～100.00%， 它們與原型株核苷酸一致性為82.53%～83.61%，氨基酸同源性為94.10%～96.39%。 cluster 1與cluster 2 的核苷酸差異率為7.01%， 氨基酸差異率為2.63%。

討 論

本次研究發(fā)現(xiàn)，自2017 年起其他EV 已經(jīng)取代EV-A71 和CV-A16 成為優(yōu)勢病原。EV-A71 自2017年起占比的明顯下降可能與EV-A71 型手足口病疫苗于2016 年問世有關(guān)。 其他EV 占比的升高可能與EV-A71 或者CV-A16 已在人群中建立了免疫屏障，從而使其他EV 成為手足口病主要病原有關(guān)[11]。 自2013年起，我國相繼出現(xiàn)了CV-A6 相關(guān)手足口病暴發(fā)流行的報道[12]。 隨后在我國的許多省份也報道了CVA6 取代EV-A71 和CV-A16 成為優(yōu)勢病原[13]，但在部分省份，如云南、四川和黑龍江的CV-A6 流行水平還很低[14]。 目前昆明市手足口病的流行中，CV-A6占比雖然不大，但已呈逐年上升趨勢，提示可能存在CV-A6 相關(guān)手足口病暴發(fā)流行的潛在風(fēng)險。

VP1 蛋白因其基因型與病毒血清型的完全對應(yīng)，一直是腸道病毒基因分型和遺傳進(jìn)化研究的重點[15]。 我國多地基于CV-A6 VP1 全長序列進(jìn)化分析的研究報道顯示：早期CV-A6 的流行主要是D3 和D2 亞型的單獨流行和共同流行，近幾年一些地區(qū)出現(xiàn)D3 亞型完全取代D2 亞型形成單獨流行[16]。 從基因進(jìn)化樹中可以看到2013 年昆明市尚有D2 亞型毒株（KY424358）的流行， 2014 和2015 年已經(jīng)出現(xiàn)CV-A6 D3a 亞 型 毒 株（LC412013、KY424357）的 流行。 本次研究中分離到的57 株CV-A6，均為D3a 亞型，與國內(nèi)多個省市地區(qū)一致[16-17]，表明CV-A6 D3a亞型近年來在昆明市的持續(xù)流行。

基于VP1 區(qū)基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)， 昆明市的57條CV-A6 分為2 個進(jìn)化分支，除1 條2017 年的序列在cluster2 外，其余56 條以及2014 和2015 年的昆明市代表株均分布在cluste1， 表明cluster1 是2016—2018 年昆明市CV-A6 流行的優(yōu)勢分支，而cluster1 又進(jìn)一步分成了不同的簇， 提示昆明市CV-A6 存在基因多態(tài)性， 而隨著基因多態(tài)性的增加， 可能引發(fā)未來昆明市CV-A6 相關(guān)手足口病流行規(guī)模的增大。 在目前其他EV 已成為昆明市手足口病優(yōu)勢病原的背景下，在今后常規(guī)監(jiān)測工作中需加強對其他EV 的監(jiān)測，同時也有必要對CV-A6 的流行及其基因特征進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測和研究。

利益沖突 所有作者均聲明沒有利益沖突

圖2 基于VP1 區(qū)構(gòu)建的2016—2018 年昆明市CV-A6 系統(tǒng)進(jìn)化樹