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昆明市手足口病病原構(gòu)成及柯薩奇病毒A 組6 型基因特征分析(2016—2018 年)

2021-05-14 00:46:10李楠姜黎黎寸建萍周曉芳曹億會楊溪田炳均
關(guān)鍵詞:昆明市毒株口病

李楠 姜黎黎 寸建萍 周曉芳 曹億會 楊溪 田炳均

云南省疾病預(yù)防控制中心急性傳染病防制所,昆明650022

手足口病是一種由多種腸道病毒(EV)引起的,主要累及兒童特別是5 歲以下嬰幼兒。 它雖是一種自限性疾病,但是重癥患兒可出現(xiàn)腦干腦炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,嚴(yán)重的可致死亡[1]。 腸道病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A16 型(CV-A16)被認(rèn)為是手足口病的主要病原[2]。 自2012 年開始出現(xiàn)相關(guān)報道后CV-A6 已經(jīng)逐漸成為中國大陸手足口病傳播的重要病原,近幾年在一些地區(qū)CV-A6 已經(jīng)取代EV-71 和CV-A16 成為手足口病暴發(fā)流行的主要病原[3]。 本研究探討了2016—2018 年昆明市手足口病病原構(gòu)成情況, 并對分離到的57 株CV-A6 毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析以闡明昆明市流行的CV-A6 基因特征。

對象與方法

一、 研究對象

本研究中的病例信息來源于中國疾病預(yù)防控制信息系統(tǒng)——傳染病報告信息管理系統(tǒng)。 收集2016—2018 年從云南省手足口病實驗室監(jiān)測系統(tǒng)采集到的2 935 份昆明市手足口病患兒的樣本,大部分為糞便樣本,少部分為咽拭子和肛拭子。 采集樣本前告知采樣對象或監(jiān)護(hù)人員采樣目的并發(fā)放知情同意書并簽字。

二、儀器和試劑

儀器包括美國ABI 公司PCR 儀Veriti 96 Well Termal Cycler, 美國Bio-Rad 公司實時熒光定量PCR 儀CFX96。試劑包括美國Promega 公司Access Quick 試劑盒 (批號:A1250), 德國QIAGEN 公司QIAamp Viral RNA Mini Kit(批號:1020953),江蘇碩世生物科技公司CV-A16 型和EV-A71 型+EV 通用型核酸檢測試劑盒(批號:20191001)。

三、研究方法

參照《手足口病實驗室手冊(第4 版)》[4]對收集到的患兒樣本進(jìn)行處理后,接種于人類橫紋肌肉瘤(RD)細(xì)胞和人喉癌上皮(Hep-2)細(xì)胞(細(xì)胞來自中國CDC 病毒病預(yù)防控制所脊髓灰質(zhì)炎實驗室)進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)。 分離到的毒株使用德國QIAGEN 公司的病毒RNA 提取試劑盒提取病毒核酸, 以提取的病毒RNA 為模板, 用CV-A16 型和EV-A71 型+EV 通用型核酸檢測試劑盒 (江蘇碩世生物科技公司)進(jìn)行實時熒光RT-PCR 檢測,并對非EV-A71 和非CV-A16 陽性樣本進(jìn)行普通RT-PCR 擴增得到VP1 全長序列,對CV-A6 病毒進(jìn)行基因進(jìn)化分析。

四、病毒分型鑒定

以非EV-A71 和非CV-A16 的陽性樣本提取的病毒RNA 為模板,使用美國Promega 公司的Access Quick RT-PCR 試劑盒和A、B 和C 組腸道病毒特異性引物[5],對毒株VP1 區(qū)基因進(jìn)行分段擴增、拼接和組裝,得到CV-A6 全長VP1 編碼區(qū)。 擴增條件:50 ℃30 min,95 ℃15 min;94 ℃30 s,45℃30 s,68 ℃50 s,40 個循環(huán);68 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司(上海)雙向測序。 測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行Blast 搜索初步定型,使用MEGA5.2 軟件分析,依據(jù)Oberste 等[6]的理論判定病毒型別。

五、CV-A6 序列分析

從GenBank 下載文獻(xiàn)[7-8]中所用的來自法國、日本、美國、芬蘭、中國臺灣及中國大陸的山東、上海、河南、廣東、云南、浙江和吉林等12 個?。ㄊ校┚哂写硇缘?2 條CV-A6 VP1 區(qū)全長序列。 用MEGA 5.2 的臨位連接法(NJ)和Kimura-2 參數(shù)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,通過可靠性Bootstrap=1 000 進(jìn)行評估。 以核苷酸平均差異>15%劃分基因型別[8-10]。

六、統(tǒng)計學(xué)分析

用Excel 錄入和導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 采用描述性流行病學(xué)方法分析手足口病流行特征及病原構(gòu)成變化。

結(jié) 果

一、昆明市手足口病流行概況

2016 年昆明市報告手足口病20 197 例, 發(fā)病率302.49/10 萬;2017 年昆明市報告14 357 例,發(fā)病率213.39/10 萬;2018 年昆明市報告23 884 例,發(fā)病率352.12/10 萬。 昆明市手足口病連續(xù)3 年病例數(shù)及發(fā)病率居云南省前5 位,并呈隔年高發(fā)的特點。 每年6 月均為發(fā)病高峰,此后發(fā)病水平逐漸下降,第二個流行高峰出現(xiàn)在12 月(見圖1)。

圖1 2016—2018 年昆明市手足口病按月發(fā)病情況

二、手足口病病原分布

2016—2018 年云南省手足口病實驗室監(jiān)測系統(tǒng)中共采集到的昆明市手足口病患兒樣本2 935份, 實驗室診斷陽性2 318 份, 陽性率78.98%。2016、2017 和2018 年檢出手足口病病原的陽性率分別為84.35%(776/920)、79.21%(785/991)和73.93%(757/1 024),病原構(gòu)成中EV-A71 占比逐年減少,CV-A16 所占比例隔年增高。 除2016 年CVA16 為優(yōu)勢病原, 其余年份均為其他EV,3 年間分離到CV-A6 共計57 株。 詳見表1。

表1 2016—2018 年昆明市手足口病病原分布[株(%)]

三、CV-A6 昆明株基因進(jìn)化分析

57 株昆明市CV-A6 毒株的VP1 區(qū)全長序列與32 條參考序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。 結(jié)果表明,2016—2017 年昆明市57 株CV-A6 與D3a 流行株親緣性最近。昆明市CV-A6 毒株分為2 個進(jìn)化分支(cluster),分支2 包含1 株昆明市2017 年的CV-A6和浙江、吉林、法國等地的6 條CV-A6 序列,cluster1則包含其余56 株昆明市CV-A6 和昆明市2014、2015 年以及中國大陸不同省份和中國臺灣的8 條代表株。

57 株昆明市CV-A6 毒株序列之間核苷酸一致性為91.69%~100.00%, 氨基酸同源性為96.39%~100.00%, 它們與原型株核苷酸一致性為82.53%~83.61%,氨基酸同源性為94.10%~96.39%。 cluster 1與cluster 2 的核苷酸差異率為7.01%, 氨基酸差異率為2.63%。

討 論

本次研究發(fā)現(xiàn),自2017 年起其他EV 已經(jīng)取代EV-A71 和CV-A16 成為優(yōu)勢病原。EV-A71 自2017年起占比的明顯下降可能與EV-A71 型手足口病疫苗于2016 年問世有關(guān)。 其他EV 占比的升高可能與EV-A71 或者CV-A16 已在人群中建立了免疫屏障,從而使其他EV 成為手足口病主要病原有關(guān)[11]。 自2013年起,我國相繼出現(xiàn)了CV-A6 相關(guān)手足口病暴發(fā)流行的報道[12]。 隨后在我國的許多省份也報道了CVA6 取代EV-A71 和CV-A16 成為優(yōu)勢病原[13],但在部分省份,如云南、四川和黑龍江的CV-A6 流行水平還很低[14]。 目前昆明市手足口病的流行中,CV-A6占比雖然不大,但已呈逐年上升趨勢,提示可能存在CV-A6 相關(guān)手足口病暴發(fā)流行的潛在風(fēng)險。

VP1 蛋白因其基因型與病毒血清型的完全對應(yīng),一直是腸道病毒基因分型和遺傳進(jìn)化研究的重點[15]。 我國多地基于CV-A6 VP1 全長序列進(jìn)化分析的研究報道顯示:早期CV-A6 的流行主要是D3 和D2 亞型的單獨流行和共同流行,近幾年一些地區(qū)出現(xiàn)D3 亞型完全取代D2 亞型形成單獨流行[16]。 從基因進(jìn)化樹中可以看到2013 年昆明市尚有D2 亞型毒株(KY424358)的流行, 2014 和2015 年已經(jīng)出現(xiàn)CV-A6 D3a 亞 型 毒 株(LC412013、KY424357)的 流行。 本次研究中分離到的57 株CV-A6,均為D3a 亞型,與國內(nèi)多個省市地區(qū)一致[16-17],表明CV-A6 D3a亞型近年來在昆明市的持續(xù)流行。

基于VP1 區(qū)基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn), 昆明市的57條CV-A6 分為2 個進(jìn)化分支,除1 條2017 年的序列在cluster2 外,其余56 條以及2014 和2015 年的昆明市代表株均分布在cluste1, 表明cluster1 是2016—2018 年昆明市CV-A6 流行的優(yōu)勢分支,而cluster1 又進(jìn)一步分成了不同的簇, 提示昆明市CV-A6 存在基因多態(tài)性, 而隨著基因多態(tài)性的增加, 可能引發(fā)未來昆明市CV-A6 相關(guān)手足口病流行規(guī)模的增大。 在目前其他EV 已成為昆明市手足口病優(yōu)勢病原的背景下,在今后常規(guī)監(jiān)測工作中需加強對其他EV 的監(jiān)測,同時也有必要對CV-A6 的流行及其基因特征進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測和研究。

利益沖突 所有作者均聲明沒有利益沖突

圖2 基于VP1 區(qū)構(gòu)建的2016—2018 年昆明市CV-A6 系統(tǒng)進(jìn)化樹

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