伍思宇，李寶財(cái)，李紀(jì)元，廖健明，韋曉娟，傅鏡遠(yuǎn)，李開祥

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530002；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江杭州 311400；3.合浦佳永金花茶開發(fā)有限公司，廣西合浦 536100）

金花茶（Camellia nitidissima）屬小喬木或常綠灌木，高度為2 ～6 m[1]，主要分布在中國廣西南部和越南北部[2]，原始生境的伴生植物主要有白櫟（Quer?cus fabri）、水冬哥（Saurauia tristyla）和白顏樹（Giron?niera subaequalis）等[3]。金花茶是山茶屬稀有的黃色種質(zhì)資源，含有豐富的黃酮類、多糖和茶多酚等化學(xué)活性成分以及鍺（Ge）和砷（Se）等微量元素[4-5]，具有極高的觀賞和科研價(jià)值[6]。

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)上發(fā)揮重要的作用[7]，其多樣性受林分、枯落物和土壤因子等因素共同影響[8-10]。Waid[11]指出植被類型和數(shù)量不同，林下凋落物及根系分泌物也不同，使土壤微生物發(fā)生變化。宋賢沖等[12]研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)、全磷（P）和全鉀（K）含量等土壤理化性質(zhì)可能是造成不同季節(jié)常綠闊葉林土壤微生物群落功能多樣性差異的主要原因。

林下套種是通過空間將目標(biāo)樹種與其他植物組合在一起的栽培模式，不僅能充分利用林地空間，增加森林單產(chǎn)，還能促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)，提高土壤肥力和土壤微生物數(shù)量[13]。吉艷芝等[14]研究表明與落葉松（Larix gmelinii）純林相比，落葉松混交林的土壤養(yǎng)分、微生物多樣性和酶活性均得到了顯著提高。由于金花茶耐陰的特性[3]，研究人員采取林下套種金花茶的栽培模式，研究金花茶的生長和光合特性[15-16]，但鮮少關(guān)注林下的土壤特性。本研究對不同樹種林下套種金花茶的土壤微生物多樣性進(jìn)行研究，探討土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，以及枯落物和土壤理化性質(zhì)對土壤微生物多樣性的影響，以期為林下套種金花茶選擇適宜的上層樹種提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于廣西合浦縣佳永金花茶開發(fā)有限公司龍門江基地（109°21'E，21°67'N），海拔12 m，屬亞熱帶海洋季節(jié)性氣候，年均氣溫22.4 ℃，年均降水量1 667 mm，年均相對濕度75% ～86%。選擇造林時(shí)間相近的3 種樹種套種金花茶，對枯落物和土壤進(jìn)行調(diào)查研究。3 種樹種分別為印度紫檀（Ptero?carpus indicus）、荔 枝（Litchi chinensis）和 濕 地 松（Pinus elliottii）（表1）。印度紫檀為高大落葉喬木[17]，林下透光度在春季、夏季、秋季和冬季分別為20%、12.5%、44.8%和100%；荔枝為常綠喬木[18]，林下透光度常年為5%左右；濕地松為常綠針葉喬木[19]，林下透光度常年為60%左右。

表1 不同套種模式基本概況Tab.1 General situation of different interplanting models

1.2 樣品采集

2018年12月—2019年12月，每3 個(gè)月采集1次枯落物。收集面積為1 m2的枯枝落葉，風(fēng)干后稱重，用于測定枯落物蓄積量，另取部分枯枝落葉樣品帶回室內(nèi)測定養(yǎng)分。

2019年6月采集土壤，測定土壤理化性質(zhì)和微生物。在3 種樹種的林地分別隨機(jī)選取3 個(gè)采樣點(diǎn)，清除表層雜質(zhì)后，用環(huán)刀取出深度為0 ～10 cm的土壤，用于土壤物理性質(zhì)分析。于平行斷面下鏟取土樣，剔除石礫和植物殘根等雜物后，將采集的土壤分別混合均勻，采用四分法，將一部分裝入15 mL 無菌離心管中冷藏，用于土壤微生物分析；另一部分置于自封袋中，用于土壤化學(xué)性質(zhì)分析。

1.3 樣品測定和數(shù)據(jù)分析

用稱重法測枯落物蓄積量[20]；凱氏定氮法測全氮（N）含量，鉬銻抗比色法測全P 含量，火焰原子分光光度法測全K 含量[21]。用烘干法測土壤含水量，環(huán)刀法測土壤容重和土壤孔隙度[22]；用電位法測土壤pH 值；用重鉻酸鉀-硫酸消化法測土壤有機(jī)質(zhì)含量，用凱氏定氮法測土壤全N含量，用鉬銻抗比色法測土壤全P 含量，用酸溶-火焰光度法法測土壤全K含量[23]。采用Excel和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

用Illumina-MiSeq 高通量測序技術(shù)（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）進(jìn)行土壤微生物群落基因組測序。采用E.Z.N.A.?soil DNA Kit 提取試劑盒（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA。細(xì)菌V3 ～V4可變區(qū)采用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌18S rDNA 的V5 ～V7區(qū)采用SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫，1%瓊脂糖電泳檢測。再將PCR 回收產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測定量，之后按照測序量，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。先連接“Y”字形連接器，再用磁珠過濾，自連接片段，然后通過PCR 擴(kuò)增文庫模板，對NaOH變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用測序公司MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測序（上海美吉生物制藥有限公司）。將原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并在美吉I-Sanger 云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)上進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析（www.majorbio.com）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同套種模式枯落物蓄積量和養(yǎng)分分析

枯落物累計(jì)年限相近時(shí)，不同林分枯落物蓄積量主要與枯落物的輸入量和分解速率有關(guān)[20]。3 種套種處理的枯落物單位面積蓄積量均呈先減少后增加的趨勢，說明枯落物隨著時(shí)間的推移會(huì)逐步分解，待到新一輪落葉期時(shí)，枯落物又會(huì)再次累積（圖1a）。在枯落物分解的過程中，枯落物的養(yǎng)分貯量也會(huì)隨之變化。PI-C 枯落物的全N、全P 和全K 含量隨時(shí)間呈波動(dòng)變化（圖1b ～d），LC-C 和PE-C 全年變化趨勢均不太明顯。PI-C枯落物全N含量呈先增多后減少再增多的趨勢，年變化量為16.36 g/kg，全年均高于LC-C和PE-C，PI-C、LC-C和PE-C凋落物全N含量 分別 為13.39 ～29.75、10.68 ～14.36 和4.90 ～8.38 g/kg。PI-C 枯落物全P 含量呈先增多后減少的趨勢，年變化量為0.51 g/kg。PI-C、LC-C 和PE-C 枯落物全P含量分別為0.55 ～1.06、0.49 ～0.68和0.20 ～0.31 g/kg，PI-C 枯落物全P 含量存在明顯優(yōu)勢。PIC 枯落物全K 含量呈先減少后增多的趨勢，年變化量為3.52 g/kg，全K 含量最大值為5.15 g/kg，分別為LC-C和PE-C全K含量最大值的1.40和2.83倍。

圖1 不同套種模式的枯落物蓄積量和養(yǎng)分貯量動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of litter volume and nutrient storage of different interplanting models

2.2 不同套種模式土壤理化性質(zhì)分析

不同套種模式對土壤的最小持水量、毛管持水量、非毛管孔隙、毛管孔隙、總孔隙度、pH、全P 和全K 含量影響顯著（P< 0.05），對土壤容重、最大持水量、有機(jī)質(zhì)和全N含量影響不顯著（表2）。土壤孔隙度能反映出土壤透水通氣性能是否良好[24]，PI-C 土壤總孔隙度最大，與LC-C 和PE-C 差異顯著（P＜0.05），說明PI-C 土壤透水通氣性最好。3 種土壤均為酸性土壤，其中PE-C 土壤pH 為4.70，與PI-C 和LC-C 差異顯著（P＜0.05）。LC-C 土壤全P 含量最高（1.08 g/kg），與PE-C差異顯著（P＜0.05），與PI-C差異不顯著；LC-C 土壤全K 含量最高（2.99 g/kg），與PI-C和LC-C均差異顯著（P＜0.05）。

表2 不同套種模式的土壤理化性質(zhì)Tab.2 Soil physical and chemical properties of different interplanting models

2.3 不同套種模式土壤微生物多樣性分析

PI-C、LC-C 和PE-C 土壤細(xì)菌群落各獲得4 471、4 310 和2 897 個(gè)OTU，真菌群落各獲得243、300 和259 個(gè)OTU，真菌細(xì)菌比分別為0.054、0.070 和0.089。對0.97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，PI-C、LC-C 和PE-C 土壤細(xì)菌群落分別歸為32 個(gè)門734 個(gè)屬、28 個(gè)門638 個(gè)屬和26個(gè)門465個(gè)屬，真菌群落分別歸為36個(gè)門124個(gè)屬、39個(gè)門136個(gè)屬和32個(gè)門117個(gè)屬。

2.3.1 不同套種模式土壤微生物Alpha多樣性分析

Chao1和Ace指數(shù)越大，說明樣本中微生物豐富度越高；Shannon 指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越小，說明樣本中微生物群落多樣性越高[25]；Coverage 指數(shù)越高，說明樣本中序列被測出的概率越高。PI-C 和LC-C土壤細(xì)菌的Chao1、Ace和Shannon指數(shù)顯著大于PE-C（P< 0.05），且Simpson 指數(shù)顯著小于PE-C（P<0.05），說明PI-C 和LC-C 土壤細(xì)菌豐富度和多樣性明顯優(yōu)于PE-C，PI-C 與LC-C 差異不顯著；PIC、LC-C 和PE-C 土壤真菌的Chao1、Ace、Shannon和Simpson 指數(shù)差異不顯著，說明3 種土壤真菌豐富度和多樣性差異不大（表3）。

表3 不同樹種套種模式的土壤微生物多樣性指數(shù)Tab.3 Soil microbial diversity index of different interplanting models

續(xù)表3Continued

2.3.2 不同套種模式土壤微生物群落組成分析

PI-C、LC-C 和PE-C 土壤優(yōu)勢細(xì)菌門分別為13、13 和12 個(gè)，其中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）在3 種土壤中均為優(yōu)勢菌群，變形菌門在3 種土壤中占比為LC-C（34.67%）＞PE-C（28.35%）＞PI-C（22.40%）；放線菌門為PE-C（30.50%）＞LC-C（23.39%）＞PI-C（11.52%）；酸桿菌 門 為PE-C（23.31%）＞PI-C（16.07%）＞LC-C（12.16%）；綠彎菌門為PI-C（29.81%）＞LC-C（13.48%）＞PE-C（6.81%）（圖2a）。在屬分類水平上，PI-C 土壤中細(xì)菌占比最多的3 個(gè)群落分別為norank_c_AD3（19.78%）、norank_f_Xanthobacterace?ae（5.73%）和norank_o_Subgroup_2（5.04%）；LC-C土壤中細(xì)菌占比最多的3個(gè)群落分別為norank_f_Xan?thobacteraceae （9.97%） 、 norank_c_Subgroup_6（4.17%）和norank_c_AD3（3.99%）；PE-C 土壤中細(xì)菌占比最多的3 個(gè)群落分別為熱酸菌屬（Acidother?mus，10.95%）、norank_f_Xanthobacteraceae（8.49%）和norank_o_Acidobacteriales（6.46%）（圖2b）。

PI-C、LC-C 和PE-C 土壤優(yōu)勢真菌為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和纖毛門（Ciliophora）。子囊菌門在3 種土壤中占比為PI-C（77.61%）＞LC-C（62.19%）＞PE-C（28.45%）；擔(dān)子菌門為PE-C（63.55%）＞LC-C（26.35%）＞PI-C（11.91%）；毛霉門 為 PI-C （5.22%） ＞LC-C （4.80%） ＞PE-C（2.49%）；纖毛門為PI-C（1.46%）＞LC-C（1.10%）＞PE-C（0.79%）（圖2c）。PI-C、LC-C 和PE-C 土壤中占比最多的細(xì)菌和真菌群落分別為綠彎菌門和子囊菌門、變形菌門和子囊菌門、放線菌門和擔(dān)子菌門。PI-C 真菌占比最多的3 個(gè)群落為unclassi?fied_f_Aspergillaceae（16.46%）、unclassified_f_Hypo?creaceae（14.12%）和毛殼菌屬（Chaetomium，13.57%）；LC-C 真菌占比最多的3 個(gè)群落為unclas?sified_f_Aspergillaceae（17.45%）、Saitozyma（15.42%）和unclassified_f_Hypocreaceae（7.75%）；PE-C 真菌占比最多的3 個(gè)群落為Saitozyma（55.68%）、unclas?sified_f_Hypocreaceae（8.26%）和毛殼菌屬（6.10%）（圖2d）。

圖2 不同套種模式土壤微生物群落（a和b：細(xì)菌；c和d：真菌）Fig.2 Soil microbial community of different interplanting models(a and b:bacteria;c and d:fungi)

3 種套種模式土壤中共有的細(xì)菌屬和真菌屬分別為351個(gè)和82個(gè)（圖3）。PI-C 土壤中特有的細(xì)菌屬為176 個(gè)，多于LC-C（25 個(gè)）和PE-C（14 個(gè)）（圖3a）。PI-C、LC-C 和PE-C 土壤中特有的真菌屬分別為17個(gè)、25個(gè)和11個(gè)（圖3b）。

圖3 不同套種模式土壤微生物屬分類水平上Venn圖（a：細(xì)菌；b：真菌）Fig.3 Venn diagram of soil microbe of different interplanting models at the genus level(a:bacteria;b:fungi)

2.3.3 不同套種模式土壤微生物與環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析

冗余分析（RDA）是環(huán)境因子約束化的PCA 分析，反映樣本分布和環(huán)境因子間的關(guān)系[26]。細(xì)菌群落多樣性與pH、有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與全P 含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），說明pH、有機(jī)質(zhì)和全P 含量共同影響土壤細(xì)菌多樣性（圖4a）；真菌群落多樣性與毛管持水量呈顯著正相關(guān)（P< 0.05），說明毛管持水量影響土壤真菌多樣性（圖4b）。

圖4 不同套種模式土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的RDA分析（a：細(xì)菌；b：真菌）Fig.4 RDA analysis of soil microbial community structure and environmental factors of different interplanting models(a:bacteria;b:fungi)

通過計(jì)算環(huán)境因子和菌群之前的Spearman 等級(jí)相關(guān)系數(shù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的pH 與赭黃嗜鹽囊菌屬（Haliangium）、Gaiella、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）、unclassified_o_Acidobacteriales、芽孢桿菌屬（Bacil?lus）、Luedemannella、土微菌屬（Pedomicrobium）呈現(xiàn)極顯著極強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.01;P<0.001；R ≥0.8）；全P 含量與赭黃嗜鹽囊菌屬、Gaiella、硝化螺旋菌屬、unclassified_o_Acidobacteriales、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）呈極顯著極強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.01;P<0.001；R ≥0.8），與norank_p_WPS-2 呈極顯著極強(qiáng)負(fù)相關(guān)（P＜0.01；R ≤-0.8）；全K 含量與芽孢桿菌屬呈極顯著極強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.01；R ≥0.8）；有機(jī)質(zhì)與norank_p_GAL15 呈極顯著極強(qiáng)負(fù)相關(guān)（P＜0.01；R ≤-0.8）（圖5a）。

真菌的容重與norank_f_Stenostomidae、有機(jī)質(zhì)含量與Nuclearia均呈極顯著極強(qiáng)負(fù)相關(guān)（P＜0.01；R ≥0.8）；全鉀含量與Plectosphaerella和枝孢屬（Cladosporium）呈極顯著極強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.01；R ≥0.8），與乳菇屬（Lactarius）呈極顯著極強(qiáng)負(fù)相關(guān)（P＜0.01；R ≥0.8）；毛管持水量與unclassified_o_Peziza?les、unclassified_o_Eurotiales 呈極顯著極強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.01；R ≤-0.8），與Saitozyma、unclassified_p_As?comycota 和雙擔(dān)菌屬（Geminibasidium）呈極顯著極強(qiáng)負(fù)相關(guān)（P＜0.01；R ≤-0.8）；pH 與Arthrobotryss、全P含量與unclassified_o_Pezizales 均呈極顯著極強(qiáng)正相關(guān)（P＜0.01；R ≤-0.8）（圖5b）。

圖5 屬分類水平上土壤微生物相對豐度與環(huán)境因子相關(guān)性（a：細(xì)菌；b：真菌）Fig.5 Correlation between relative abundance of soil microbes and environmental factors at genus level(a:bacteria;b:fungi)

3 討論與結(jié)論

3.1 不同套種模式枯落物對土壤微生物多樣性的影響

不同植物的凋落物理化性質(zhì)不同，分解時(shí)釋放的養(yǎng)分也具有差異性，對土壤微生物生長具有選擇性刺激作用，進(jìn)而影響微生物群落結(jié)構(gòu)和功能及其多樣性[27]。本研究表明印度紫檀×金花茶林、荔枝×金花茶林土壤細(xì)菌豐富度和多樣性明顯優(yōu)于濕地松× 金花茶林，這與Klimek 等[28]研究結(jié)果相似，闊葉樹種較針葉樹種具有更高的土壤微生物活性和功能多樣性，亦與張信思[3]調(diào)查發(fā)現(xiàn)的野生金花茶原生生境的伴生植物多為闊葉林的特性相一致。

土壤細(xì)菌真菌比可反映細(xì)菌和真菌的相對豐富度[29]。在本研究中，印度紫檀×金花茶林的細(xì)菌真菌比明顯高于荔枝× 金花茶林和濕地松× 金花茶林，可能是因?yàn)橛《茸咸础两鸹ú枇挚萋湮锏娜玁 和全P年變化量均明顯高于其他兩種林地，有研究表明枯落物中的N、P 元素釋放量越高，越有利于細(xì)菌的生長[30]。在后續(xù)研究中，還需進(jìn)行枯落物礦化速率試驗(yàn)進(jìn)一步闡明不同金花茶套種模式的枯落物對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響。

3.2 不同套種模式土壤理化性質(zhì)對微生物多樣性的影響

土壤微生物對環(huán)境極為敏感，森林類型和土壤理化性質(zhì)是影響其多樣性的重要因素[31-32]。RDA 結(jié)果表明，pH、有機(jī)質(zhì)和全P 含量對土壤細(xì)菌多樣性的影響較大，其中，全P 含量的影響最大，呈極顯著相關(guān)；毛管持水量則影響土壤真菌多樣性。宋賢沖等[12]研究發(fā)現(xiàn)全P 含量與土壤微生物多樣性指數(shù)極顯著相關(guān)，有機(jī)質(zhì)與土壤微生物多樣性表現(xiàn)為顯著相關(guān)；邵穎等[33]研究表明pH 值與土壤細(xì)菌群落多樣性有關(guān)，與本研究的發(fā)現(xiàn)一致?？紫抖取⑷玁和全K 含量對土壤微生物多樣性貢獻(xiàn)不大，這與趙春梅等[34]的研究結(jié)果不一致，可能是收獲金花茶花朵和葉片時(shí)人為活動(dòng)較多所致，且孔隙度、全N和全K并不能影響所有土壤微生物群落。根據(jù)相關(guān)性Heat?map 分析結(jié)果可知，pH、有機(jī)質(zhì)、全P 和全K 含量可與部分細(xì)菌屬種類呈極顯著極強(qiáng)相關(guān)性，容重、毛管持水量、pH、全P含量和全K含量可與部分真菌屬呈極顯著極強(qiáng)相關(guān)性。

土壤生境不同，主要菌群的豐度和結(jié)構(gòu)不同[35]。由于3 種套種模式土壤的孔隙度、pH、全P 和全K 含量均差異顯著，使土壤生境具有差異。3 種套種模式土壤中的優(yōu)勢微生物均為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門4個(gè)細(xì)菌菌群和子囊菌門、擔(dān)子菌門2 個(gè)真菌菌群，研究結(jié)果與張勝男等[35]和Han?son 等[36]的基本一致。有研究認(rèn)為綠彎菌門和富營養(yǎng)化程度有關(guān)[37]，酸桿菌門與貧瘠的土壤環(huán)境有關(guān)[38]，子囊菌門能利用環(huán)境中多種養(yǎng)分供其生長[39]，擔(dān)子菌門可作為土壤擾動(dòng)強(qiáng)弱的指示真菌[40]。印度紫檀×金花茶林土壤微生物豐富度和多樣性最高，占比最多的是綠彎菌門和子囊菌門，特有的細(xì)菌屬種類也遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他兩種模式的土壤，可能原因是印度紫檀×金花茶林枯落物代謝較快，更多養(yǎng)分流入土壤。荔枝× 金花茶林土壤中占比最多的是變形菌門和子囊菌門，濕地松×金花茶林土壤中占比最多的是放線菌門和擔(dān)子菌門。

本研究結(jié)果表明，枯落物蓄積量、全N 和全P年變化量以及土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全P 含量和毛管持水量能影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。綜合考慮土壤理化性質(zhì)和微生物多樣性，在林下套種金花茶栽培模式中，宜選擇落葉闊葉林作為上層林樹種。