晏顯芳，張 明，郭 盼，李 楊，于海波，吉 紅，周繼術(shù)

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是一種重要的淡水養(yǎng)殖魚類，大約占全球淡水養(yǎng)殖業(yè)的16%(Wang et al, 2015)。目前，在世界范圍內(nèi)的淡水養(yǎng)殖魚類中，草魚的產(chǎn)量最高(張露等，2016)。草魚由于其生長速度快、肌肉品質(zhì)細(xì)膩鮮美、養(yǎng)殖效益好等優(yōu)點深受廣大消費者和養(yǎng)殖戶的青睞。然而，隨著草魚高密度養(yǎng)殖模式的普及和高能飼料的普遍使用，其肝脂代謝紊亂及腸道損傷情況越來越多見，肝臟變性、脂肪肝等疾病頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響魚體的健康狀況。

丁酸屬短鏈脂肪酸，可作為腸道上皮的直接能量來源，還具有重要的生理調(diào)控作用；不僅可促進(jìn)小腸黏膜的生長發(fā)育，增強(qiáng)黏膜的通透性，修復(fù)受損腸道上皮細(xì)胞，增加絨毛的寬度，提高小腸消化吸收功能，還能促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖，并修復(fù)腸道受損部位，從而促進(jìn)腸道健康。由于丁酸具有揮發(fā)性及特殊氣味，在生產(chǎn)上常用丁酸鈉替代。已有研究表明，丁酸鈉能改善鯉魚、羅非魚與鯽魚的腸道健康，但在草魚飼料中尚未見相關(guān)報道。研究還發(fā)現(xiàn)，丁酸通過降低胰島素的敏感性，從而降低小鼠白色脂肪組織中的脂質(zhì)積累；而這種抑制脂質(zhì)蓄積的作用未能在小鼠的肝臟和肌肉組織中發(fā)現(xiàn)。丁酸在魚類或在草魚中是否也具有相應(yīng)的調(diào)節(jié)脂質(zhì)蓄積的作用，相關(guān)報道較為缺乏。

為探索丁酸鈉對草魚生長、脂代謝及健康狀況的影響，本研究在草魚飼料中添加不同水平的丁酸鈉，通過56 d的飼養(yǎng)試驗及檢測相關(guān)指標(biāo)，以期探索丁酸對草魚生長、脂質(zhì)代謝、腸道組織結(jié)構(gòu)、免疫應(yīng)答的影響，為丁酸鈉在草魚飼料中的適宜添加水平提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料

試驗飼料所用的基礎(chǔ)飼料原料由魚粉、豆粕、菜粕、棉粕、豆油等組成。丁酸鈉由新奧生物科技有限公司(福建省廈門市)提供。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、500、1000 mg Kg-1丁酸鈉，制成等氮(約36%粗蛋白)和等能(約6%粗脂)的三組試驗飼料(SB0、SB500及SB1000)。將飼料原料粉碎，過60目篩，混勻后，由飼料顆粒機(jī)制成直徑2 mm的顆粒飼料。飼料在室溫下風(fēng)干12 h后-20℃保存?zhèn)溆谩ｏ暳吓浞匠煞趾统Ｒ?guī)營養(yǎng)成見表1。

表1 試驗飼料配方組成以及常規(guī)營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 試驗魚的分組及飼養(yǎng)管理

將153尾草魚(14.10±0.60 g)隨機(jī)分為3個組，每組三個重復(fù)，每個重復(fù)17尾，養(yǎng)殖于9個循環(huán)流水養(yǎng)殖缸(130 L)中，分別飼喂以上三組試驗飼料。預(yù)飼三周后，進(jìn)行正式飼喂。飼養(yǎng)試驗中，每天投飼3次(8∶30、12∶30、16∶30)，投飼率為2%～3%，飼養(yǎng)周期為56 d。保持流水水量5 L min-1，定期檢測相關(guān)水質(zhì)參數(shù)。試驗期間，水溫25.50±2℃，pH 7.65±0.20，溶解氧7±0.50 mg L-1，硝酸鹽0.09±0.01 mg L-1。

1.3 采樣

飼喂結(jié)束后，饑餓24 h，然后用三胺甲基磺酸鹽(MS-222， 0.06 g L-1)麻醉。進(jìn)行尾靜脈采血，保存在4℃冰箱中，6 h后離心(1 000 rpm，10 min)制備血清。將每尾魚稱重并解剖，分別剖取草魚肝胰臟、腹脂、腸、腎和脾，分別稱重。按以下公式進(jìn)行魚體生長及生物學(xué)性狀的計算。

特定生長率Specific growth rate(SGR)= (ln終重- ln初重)/飼養(yǎng)時間(d)×100；

投飼量Feed intake(F1，%，魚/d) =飼料總消耗量(g)；

飼料系數(shù)Feed conversion ratio(FCR)=飼料投飼量(g)/魚體增重量(g)；

肥滿度Condition factor(CF，g/cm3%)=體重(g)/體長(cm)3×100；

肝臟指數(shù)Hepatopancreas index(HSI，%)=肝胰臟重量(g)/魚體重(g)×100；

脾臟指數(shù)Spleen index (SI，%)=脾臟重量(g)/體重(g)×100；

腸長比Relative intestine length (RIL, %)=腸長(cm)/魚體長(cm)×100；

內(nèi)臟指數(shù)Viscerosomatic index(VSI，%)=內(nèi)臟重量(g)/體重(g)×100；

腸體質(zhì)量比Intestinal index (II, %)=腸重(g)/體重(g)×100；

腹臟脂肪指數(shù)Intraperitoneal fat index(IFI， %)=腹腔內(nèi)脂肪重量(g)/體重(g)×100；

存活率Survival rate (SR, %)=末期魚數(shù)量/初始魚數(shù)量(g)×100；

將每箱3尾魚的肝胰臟和小腸凍存于液氮中，并于-80℃保存，用于分析與免疫應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá)。每箱取3尾魚的腸道收集到5 mL離心管中，冷凍于液氮中，-80℃保存，用于腸道菌群分析。另外2尾魚切除肝胰臟、腸和肌肉，保存于-20℃，進(jìn)行常規(guī)營養(yǎng)成分分析。同時，將另外3尾魚的肝胰臟和中腸固定在多聚甲醛溶液中進(jìn)行HE染色及組織學(xué)觀察與分析。

1.4 血清生化指標(biāo)測定

采用全自動生化分析儀(日立7180，東京，日本)對草魚血清進(jìn)行分析。血清生化指標(biāo)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、葡萄糖(Glu)、膽固醇(Chol)、甘油三酯(TG)。

1.5 飼料和魚肉的常規(guī)營養(yǎng)成分檢測

檢測并分析了飼料和魚體肝胰臟、肌肉和腸道的常規(guī)營養(yǎng)成分，其中粗蛋白含量用凱氏定氮法，粗脂肪含量用乙醚抽提法，粗灰分含量馬弗爐550℃灼燒法進(jìn)行測定，具體方法見AOAC(2000)。

1.6 肝胰及腸道組織的HE染色觀察

將固定后的肝胰臟和小腸于自來水中洗滌12 h，然后常規(guī)乙醇脫水和二甲苯平衡，隨后，按照之前所述的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)程序，用紗布包裹樣品(Liu et al, 2016) ，再使用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2235，德國萊卡)連續(xù)切割厚5 μm的石蠟切片，有蘇木精和伊紅染色(H&E)染色。使用倒置顯微鏡(OPTEC)拍攝切片組織樣品。

1.7 實時定量檢測基因相對表達(dá)量

分別從3尾魚的肝胰臟和腸組織中檢測tlr22和myd88基因的表達(dá)。使用TRNzol試劑(TaKaRa，中國大連)提取草魚肝胰臟和腸組織中總RNA。用所需量的無酶水溶解RNA，在260 nm～280 nm用電泳2%瓊脂糖凝膠和UV-Vis光譜儀檢測RNA的質(zhì)量和數(shù)量。在20 μL的反應(yīng)體積內(nèi)，將清洗后的總RNA反向轉(zhuǎn)錄1 μg制備所有的cDNAs。qRT-PCR使用CFX 96實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad， Hercules， CA， USA)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的總體積為20μL，其中每個引物0.6μL(10μM)，cDNA 1μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL，無酶雙蒸水7.8 μL。循環(huán)條件為：95℃ 3 min， 95℃ 15 s，60℃ 30 s， 65℃ 5 s，38次循環(huán)。目的基因tlr22及myd88的引物序列見表2。采用 (Livak and Schmittgen 2001)中描述的相對定量方法計算基因相對表達(dá)量。

表2 實時定量PCR中使用的引物

1.8 腸道微生物區(qū)系檢測

分析腸道菌群時，使用PowerSoil DNA分離試劑盒從魚糞混合樣本中提取總DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，納米滴檢測DNA純度，然后用引物338F(5’- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’)和806R(5’- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用磁珠純化法純化。對純化后的產(chǎn)物進(jìn)行Solexa PCR，再用1.8%瓊脂糖凝膠在120V恒壓下電泳40 min，使用IlluminaHiSeq 2500 (Biomarker，北京，中國)切除、純化并測序相應(yīng)的條帶。

1.9 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。結(jié)果采用單因素方差分析，所有分析均使用PASW Statistics 18(SPSS，IL，USA)進(jìn)行，然后進(jìn)行Duncans檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 草魚生長性能和生物學(xué)參數(shù)

飼養(yǎng)8周后，SB1000組草魚臟體比(VSI)顯著低于對照組(P< 0.05)；SB500和SB1000組草魚腹脂指數(shù)(IFI)顯著低于對照組(P<0.05)；其它指標(biāo)，如草魚初始體重(IBW)，特定生長率(SGR)、飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)、肥滿度、肝胰臟指數(shù)及脾臟指數(shù)等在各組間均無顯著差異(P> 0.05)。

表3 丁酸鹽對草魚生長性能和生物學(xué)指標(biāo)的影響(n=3)

3.2 血清生化指標(biāo)

血清生化指標(biāo)檢測表明，SB500組的草魚血清TP和Chol水平顯著低于對照組(P<0.05)；SB1000組草魚的血清GLO水平顯著高于SB500組(P<0.05)，而大部分草魚血清ALT、AST、ALB、GLU、TG、Chol等，不受丁酸鈉添加水平的影響(P>0.05)。

表4 丁酸鹽對草魚血清生化指標(biāo)的影響(平均值±SD，n=3)

3.3 魚體常規(guī)營養(yǎng)成分測定

在草魚肌肉和肝胰臟中，SB500和SB1000組的粗蛋白和粗脂質(zhì)含量均顯著低于對照組(P<0.05)肌肉粗灰分含量在SB500和SB1000組中顯著升高(P<0.05)。SB1000組小腸粗蛋白含量高于對照組(P<0.05)；但丁酸鹽的添加對小腸粗脂質(zhì)含量無明顯降低作用(P> 0.05)。

3.4 組織學(xué)觀察

肝胰臟HE染色觀察顯示，與對照組相比，丁酸鹽的添加(SB500及SB1000組)使草魚肝胰臟中的白色空泡狀的脂滴面積和數(shù)量有減小的趨勢。

腸道HE染色觀察顯示，丁酸鹽的添加，草魚腸道絨毛高度呈上升趨勢；通過對草魚腸道絨毛高度的測定，結(jié)果顯示，SB500和SB1000等丁酸鹽的添加水平，均顯著增加了草魚腸道中腸絨毛高度(P<0.05)。

圖2 草魚腸道HE染色觀察(n=3)

3.5 基因相對表達(dá)量檢測

丁酸鈉的添加顯著提高了基因tlr22和myd88在肝胰臟中的相對表達(dá)量(P<0.05)，這種表達(dá)量的升高在SB500和SB1000組間無顯著差異(P>0.05)(圖4)。丁酸鈉的添加對基因tlr22和myd88在腸道組織中相對表達(dá)量無顯著影響，各組間基因tlr22和myd88mRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)(圖5)。

圖4 草魚肝臟基因tlr22和myd88的相對表達(dá)量(n=3)

圖5 草魚腸道組織tlr22和myd88的基因相對表達(dá)量(n=3)

3.6 腸道菌群

結(jié)果顯示，不同水平丁酸鹽對草魚腸道細(xì)菌群落的總序列無顯著影響(P>0.05)。SB1000組腸道菌群ACE指數(shù)和操作分類學(xué)單位(OUTs)均顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，SB1000組腸道細(xì)菌群Simpson多樣性指數(shù)無顯著差異，但該組的Shannon多樣性指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05，表6)。

表6 草魚腸道微生物菌群的細(xì)菌多樣性指數(shù)(n=3)

對草魚腸道內(nèi)菌群在分類為門上的分析表明，腸道內(nèi)優(yōu)勢菌種為梭桿菌(Fusobacteria)和變形桿菌(Proteobacteria)，其中梭桿菌占總菌數(shù)的30%～70%，且丁酸鈉的添加有增加梭桿菌占比的趨勢，但與對照組相對差異并不明顯(P>0.05)。變形桿菌為第二優(yōu)勢菌，占比10%～40%，且該菌受丁酸鈉的影響，表現(xiàn)為SB1000顯著降低了變形桿菌在總菌群中的占比(P<0.05，圖6)。

圖6 草魚腸道微生物菌群在門類水平上的相對豐度(n=3)

對草魚腸道內(nèi)菌群在分類為屬上的分析表明，醋酸桿菌cetobacterium為草魚腸道優(yōu)勢菌種，占比為44%～70%，擬桿菌Bacteroidetes為第二優(yōu)勢菌，占比在10%以內(nèi)(圖7)。結(jié)果表明，丁酸鈉的添加對醋酸桿菌與與擬桿菌的占比無顯著影響，但有提升的趨勢。SB0組(44.68%)相比，雖然納入SB500(60.46%)和SB1000(70.24%)后Cetobacterium的相對豐度有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與SB0組(0.39%)相比，補充theSB500組(2.94%)和SB1000組(9.68%)似乎增加了擬桿菌的相對豐度，但增加無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 草魚腸道微生物菌屬水平的相對豐度(n=3)

3 討論

4.1 丁酸鹽對草魚生長的影響

研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加2 000 mg·kg-1的丁酸鈉可以提高草魚幼魚的生長、抗氧化能力和腸道吸收能力(Liu et al，2016)。在本試驗研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉在草魚飼料中的添加，各組之間草魚的生長性能沒有顯著差異，這與丁酸鹽在草魚(Liu et al，2016)、大西洋鮭魚(Bjerkeng et al, 1999)和非洲鯰魚(Owen et al.，2006)的研究結(jié)果一致。本試驗結(jié)果與Liu等(2016)在草魚中的報道不相一致的原因，可能與該研究用了較高的丁酸鈉添加水平(2 000 mg kg-1)有關(guān)，而本研究中最高的丁酸鈉添加水平僅為1 000 mg kg-1。

4.2 丁酸鹽對草魚脂質(zhì)蓄積的影響

本研究顯示，SB500和SB1000組的腹腔脂肪指數(shù)顯著低于對照組(表2)，同時丁酸鈉的添加使草魚具有較低的內(nèi)臟指數(shù)，顯示出丁酸鈉具有抑制腹腔脂肪蓄積的作用。這在C57BL/6小鼠的白色脂肪組織中，丁酸鹽也顯示了相似的抑制脂肪蓄積效果(Zhouet al，2016)；這可能與短鏈脂肪酸抑制脂肪分解并誘導(dǎo)“褐變”，增加產(chǎn)熱能力，從而導(dǎo)致機(jī)體脂肪減少(Sahuri-Arisoylu et al，2016)有關(guān)，也可能與短鏈脂肪酸介導(dǎo)的GPR43被激活，而該GPR43的激活抑制了脂肪細(xì)胞中的胰島素信號，從而抑制了脂肪組織中脂肪的堆積(Kimura et al, 2013)有關(guān)。

在本試驗結(jié)果顯示，SB500和SB1000的魚的肝胰腺和肌肉中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)積累顯著減少(表5，圖1)。這與許多研究的發(fā)現(xiàn)相一致，如小鼠研究(Jin et al ， 2016；Zhou et al， 2016；Sahuri-Arisoylu et al，2016；Kimura et al, 2013；Khan et al, 2016)。Sahuri-Arisoylu等(2016)報道，短鏈脂肪酸在肝臟中減少脂質(zhì)積累，改善肝功能，并提高線粒體效率。短鏈脂肪酸介導(dǎo)的GPR43激活抑制胰島素介導(dǎo)的脂肪積累，從而通過抑制多余能量的積累和促進(jìn)脂肪消耗來調(diào)節(jié)能量平衡(Kimura et al, 2013)。SB可以對直接和/或間接參與脂質(zhì)代謝的各種調(diào)控基因和/或蛋白質(zhì)進(jìn)行微調(diào)(Khan et al, 2016)。因此，不同水平的SB可以提高線粒體效率，從而導(dǎo)致肝區(qū)和肌肉的減少。

表5 丁酸鹽添加水平對草魚組織中常規(guī)營養(yǎng)成分的影響 (鮮樣，%；n=3)

圖1 草魚肝胰臟HE染色觀察

在水平試驗中，SB1000促進(jìn)了蛋白在腸內(nèi)的沉積。丁酸鹽似乎增加了幾種必需氨基酸和核苷酸衍生物的可用性。此外，使用丁酸鹽作為燃料可能會降低葡萄糖和氨基酸氧化，從而增強(qiáng)腸細(xì)胞的能量供應(yīng)(Robles et al，2013)。據(jù)我們所知，SB是一種膳食HDAC抑制劑，HDACs調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化，一種控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的表觀遺傳修飾(Mathew et al，2010)。此外，丁酸鹽的添加逆轉(zhuǎn)了極端日糧(Benedito-Palos et al ， 2016)喂養(yǎng)的魚的肌肉中蛋白分解(CDH15、CAPN3、PSMA5、PSMB1、UBE2N)的上調(diào)表達(dá)(Benedito-Palos et al，2016)。因此，SB似乎是通過下調(diào)肌肉中蛋白分解相關(guān)基因的表達(dá)而增加蛋白質(zhì)含量的。然而，在飼喂分級SB水平的草魚中，肌肉的粗蛋白和脂質(zhì)沒有顯著差異(Liu et al，2016)。這些不同的結(jié)果可能是由于魚的大小和養(yǎng)殖條件的差異所致，相關(guān)問題尚需進(jìn)一步研究。

4.3 丁酸鹽對草魚機(jī)體健康

4.3.1 丁酸鹽對草魚血清生化指標(biāo)的影響 在水平試驗中，血清AST和ALT的活性一般與肝損傷有關(guān)，其升高時是肝壞死的標(biāo)志(Wang et al， 2015)。本研究結(jié)果顯示，丁酸鈉的添加水平對血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性無顯著影響，顯示出該SB添加水平對草魚肝胰臟健康無負(fù)面影響。

研究發(fā)現(xiàn)，血清總蛋白和白蛋白反映了機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、合成和分解。血清總蛋白和白蛋白的減少是機(jī)體營養(yǎng)不良、肝臟疾病和炎癥的反應(yīng)(Artacho et al， 2007)。血液中GLO含量是保持機(jī)體健康和維持正常免疫功能的主要因素，體現(xiàn)了先天免疫機(jī)能(Talpur et al，2014)。本試驗顯示，與飼喂對照飼料的魚相比，SB500組的血清總蛋白水平顯著降低，但SB1000組魚體血清總蛋白升高，表明添加較高水平SB對草魚機(jī)體健康更有益。本研究結(jié)果顯示，與SB500組相比，SB1000組的草魚血清GLO水平明顯更高，間接說明在先天免疫方面，SB1000飼料可能優(yōu)于SB500飼料。Kurihara等(1985)發(fā)現(xiàn)，SB可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞中GLO的合成。Ahmed等人(2015)報道，在3 g/10 kg日糧中添加SB會導(dǎo)致OreochromisNiloticus的總蛋白、白蛋白和GLO增加。此外，我們發(fā)現(xiàn)，A/G(蛋白-球蛋白比值)在SB1000組中明顯低于SB500組。SB1000組的GLO水平可能是所有組中最高的。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在SB500組中，Chol水平顯著降低，提示草魚體內(nèi)脂質(zhì)運輸水平顯著降低。各研究組血清TG無差異。因此，SB的低水平可能會抑制草魚的脂溶或破壞膽固醇的合成能力。此外，SCFAs激活GPR43促進(jìn)其他組織中多余能量的利用，而不是將多余能量作為脂肪儲存在脂肪組織中，從而維持代謝穩(wěn)態(tài)(Kimura et al，2013)。然而，在類型試驗中，本研究表明，不同類型的SB處理對草魚血清生化指標(biāo)沒有影響，這間接說明不同類型的SB可能不會影響草魚血清生化指標(biāo)。在小鼠(Zhou et al， 2016)和裂頭海鱸 (Estensoro I et al，2016)中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，血清TG、Chol和Glc無顯著差異。Ju 等(2015)發(fā)現(xiàn)補充不同類型的SB不會影響血清TP、白蛋白和GLO含量。因此，對于SB對血清生化指標(biāo)的影響似乎沒有共識。

4.3.2 丁酸鹽對草魚腸道健康及微生物菌群的影響 腸是魚類營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，而腸絨毛在這一過程中發(fā)揮著重要作用。本試驗結(jié)果顯示，飼喂不同水平丁酸鈉，草魚中腸的絨毛高度均顯著上升(圖3)，說明不同水平SB均能改善草魚的腸道結(jié)構(gòu)。Liu(2014)在鯉魚和Hassanin(2015)在兔中也報道了類似的結(jié)果。SB似乎可以為腸上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)水和鈉的吸收，從而增加腸上皮細(xì)胞的增殖和十二指腸黏膜的生長(Zuo et al，2013；Guilloteau et al， 2010；Huet al,2007)。

圖3 丁酸鈉添加水平對草魚腸道絨毛高度的影響(μm)

4.3.3 丁酸鹽對草魚免疫機(jī)能的影響 骨髓分化因子88(myd88)是一個類似適配器樣的蛋白質(zhì)，參與受體(IL-1R)及toll樣受體(tlr22)介導(dǎo)的核激活因子(NF-κB)(Lin et al, 2015)。在本試驗中，myd88和 tlr22的mRNA相對表達(dá)量在SB500及SB1000組的肝胰臟中均較高(圖4)，表現(xiàn)出丁酸鈉的添加促進(jìn)了草魚的免疫應(yīng)答能力，這在歐洲海鱸(Terova et al,2016)及雄性大鼠(Mattace et al， 2013)中也有相似的發(fā)現(xiàn)。組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)是一類蛋白酶，對染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。Sheikh 等(2016)報道了myd88的乙?；饔?，通過調(diào)節(jié)tlr依賴信號通路到細(xì)胞因子基因，進(jìn)而影響HDAC抑制劑的抗增殖作用。因此推測，丁酸鹽改善草魚肝胰臟免疫應(yīng)答的功能可能與丁酸鈉是HDAC抑制劑有關(guān)。

研究顯示，丁酸鹽改善草魚免疫應(yīng)答的功能還具有組織特異性，因為在本試驗中，丁酸鈉的添加對草魚腸道m(xù)yd88和tlr22的相對表達(dá)量無顯著影響(圖5)，表現(xiàn)出丁酸鈉不影響腸道的免疫應(yīng)答機(jī)能，這在歐洲海鱸(Terova et al,2016)的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，但與在鯉魚的研究結(jié)果不一致，在鯉魚的研究中發(fā)現(xiàn)，鯉魚飼料中添加丁酸鈉可以顯著改善腸道的免疫應(yīng)答(Liu et al, 2014)。飼料丁酸鈉對不同魚類腸道組織的免疫反應(yīng)影響的差別，與魚的種類、魚的大小、養(yǎng)殖條件及丁酸鈉的添加水平差異有關(guān)，相關(guān)問題尚需進(jìn)一步研究。

4.3.4 丁酸鹽對草魚腸道菌群的影響 目前，丁酸鹽對腸道菌群影響的研究主要集中在有益或有害細(xì)菌豐度的變化上，而對淡水魚腸道微生物菌群多樣性的影響，研究并不充分。本試驗結(jié)果顯示，SB1000組的Shannon指數(shù)顯著降低(表6)，說明SB1000可以降低腸道微生物種群多樣性(Wang et al， 2012)。研究表明，飼料中添加SB1000會降低草魚腸道的pH，從而導(dǎo)致腸道細(xì)菌的膜損傷(Hoseinifar et al.，2017)，隨著孵育時間的延長，細(xì)菌細(xì)胞不僅會失去重要離子，還會失去細(xì)胞質(zhì)中的溶質(zhì)，從而導(dǎo)致菌體的生長受到抑制，嚴(yán)重情況下導(dǎo)致細(xì)菌生存能力的喪失(Hu et al，2007；Guilloteau et al，2010)。此外，Lu等(2008)還發(fā)現(xiàn)，補充1 000 mg·kg-1SB可顯著減少腸道的梭狀芽胞桿菌和大腸桿菌的活菌數(shù)。而在SB1000中ACE指數(shù)明顯低于對照組，說明SB1000可以顯著增加腸道細(xì)菌豐度。然而，Liu等(2014)發(fā)現(xiàn)添加300mg kg-1的SB不能提高普通鯉魚腸道菌群的豐度，這種差異可能與丁酸鈉對腸道菌群豐度的影響存在劑量反應(yīng)效應(yīng)有關(guān)。在本試驗中，鯨桿菌(Cetobacterium)和擬桿菌(Bacteroides)的相對豐度有隨著丁酸鹽的添加而有增加的趨勢，且該兩種菌在SB1000組的相對豐度最高(表6)，表現(xiàn)了丁酸鹽提高了該菌在草魚腸道中的定植，這在雞(Biagi et al, 2007)等動物中也發(fā)現(xiàn)了類似的效果。擬桿菌門中的擬桿菌屬在糖類代謝、營養(yǎng)物質(zhì)吸收、健康的維持和上皮細(xì)胞的成熟與維持等方面發(fā)揮著非常重要的作用(Hooper et al，1999； Eckburg et al，2005)。鯨桿菌是梭桿菌中的一種，它在魚的消化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用(Lyons et al, 2017)。醋酸是鯨桿菌從蛋白質(zhì)或碳水化合物(Finegold et al, 2003)中得到的主要最終產(chǎn)物。微生物群落的微小差異可能是由于腸黏膜形態(tài)和免疫應(yīng)答的改變所致(Liu et al, 2014)。此外，變形菌(Proteobacteriain)在SB1000組中的相對豐度顯著低于對照組(圖6)，這可能與環(huán)境或宿主因素的變化，如低纖維日糧和急性或慢性炎癥，體內(nèi)平衡被破壞，具有選擇性，并導(dǎo)致腸道內(nèi)變形細(xì)菌大量繁殖的生態(tài)失調(diào)(Shin et al, 2015)有關(guān)。綜上所述，在飼料中添加丁酸鈉1 000 mg·kg-1，可抑制草魚脂質(zhì)積累，提高其免疫力，促進(jìn)其健康。