吳 梅，韓 瑞，周 典，劉 燕，肖 春*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500)

馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaeaoperculella(Zeller)為鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae昆蟲(chóng)，寡食性，主要為害馬鈴薯、煙草等茄科植物。該蟲(chóng)害在世界各地蔓延迅速，在我國(guó)已由云南、貴州等西南地區(qū)向西北、華南擴(kuò)散，且有為害蔓延加重之勢(shì)，已成為馬鈴薯主要害蟲(chóng)之一(陸慶光和曹驥, 1983; Trivedi and Rajagopal, 1992; 朱國(guó)慶等, 2003; Kwonetal., 2017;徐進(jìn)等, 2019)。馬鈴薯塊莖蛾的幼蟲(chóng)在田間蛀食馬鈴薯新鮮植株而導(dǎo)致減產(chǎn)，或是在倉(cāng)貯期蛀食馬鈴薯塊莖，導(dǎo)致馬鈴薯不能食用或無(wú)法銷售而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯是主糧亦是蔬菜，在貯藏期間，安全、有效防治馬鈴薯塊莖蛾蟲(chóng)害對(duì)保障馬鈴薯倉(cāng)貯安全及食用安全十分重要(Upamanyaetal., 2014; Ibrahim, 2015)。

對(duì)蛾類害蟲(chóng)綜合防治中的“Push-Pull”和“Attract-Kill”策略，是通過(guò)行為調(diào)控方式控制害蟲(chóng)種群密度，以減輕害蟲(chóng)的發(fā)生和為害，這是一種綠色、有效的害蟲(chóng)防治方法(Cooketal., 2007; 陸宴輝等, 2008; Kroschel and Zegarra, 2013)。研究人員通過(guò)馬鈴薯塊莖蛾信息素，如性信息素、幼蟲(chóng)蟲(chóng)糞揮發(fā)物，或是從其寄主或非寄主揮發(fā)物中尋找具有顯著引誘或忌避作用的化學(xué)物質(zhì)，闡釋調(diào)節(jié)其行為的化學(xué)機(jī)制，以期運(yùn)用于馬鈴薯塊莖蛾蟲(chóng)害綜合防治中(Maetal., 2013, 2016; 王春婭等, 2018; Zhangetal., 2019; Lietal., 2020)。

牡丹皮是一味具有芳香氣味的常用中藥，來(lái)源于毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮(國(guó)家藥典委員會(huì)，2015)。牡丹皮在貯存過(guò)程中不會(huì)發(fā)生蟲(chóng)蛀，人們還利用它來(lái)保護(hù)其它藥材，如與澤瀉分層存放，可使?jié)蔀a免受蟲(chóng)害(王疏梅, 1998)。根據(jù)上述現(xiàn)象，推斷其揮發(fā)物中含有防蟲(chóng)的活性成分，而丹皮酚是牡丹皮揮發(fā)物中的主要成分(武子敬和蘭蘭, 2011)。有關(guān)丹皮酚在害蟲(chóng)防治領(lǐng)域的研究報(bào)道還很少，夏傳國(guó)等(1999, 2000)報(bào)道了丹皮酚對(duì)倉(cāng)貯害蟲(chóng)藥材甲StegobiumpaniceumL.具有熏蒸、觸殺及忌避作用；Xuetal. (2003)測(cè)試了丹皮酚對(duì)家蠅Muscadomestica的胃毒作用；Taketal. (2006)報(bào)道了丹皮酚有顯著的殺螨蟲(chóng)作用。目前尚無(wú)丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾防治作用的相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)研究丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵選擇及初孵幼蟲(chóng)、老熟幼蟲(chóng)的忌避作用，為其作為一種有潛力的植物源忌避劑用于馬鈴薯倉(cāng)貯期馬鈴薯塊莖蛾蟲(chóng)害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

馬鈴薯塊莖蛾室內(nèi)飼養(yǎng)方法參考劉燕等(2016)。成蟲(chóng)放入養(yǎng)蟲(chóng)盒中，喂以10%蜂蜜水，盒子頂端開(kāi)口封24目紗網(wǎng)，上置濾紙，作為產(chǎn)卵場(chǎng)所并便于蟲(chóng)卵的收集。待卵孵化后，將初孵幼蟲(chóng)接種在新鮮馬鈴薯上(品種為“合作88”)，飼養(yǎng)密度為20頭/馬鈴薯(130±2 g)，將感染幼蟲(chóng)的馬鈴薯放入事先鋪有細(xì)沙的養(yǎng)蟲(chóng)籠中，老熟幼蟲(chóng)會(huì)從馬鈴薯中爬出，鉆入沙中化蛹，直至成蟲(chóng)羽化。養(yǎng)蟲(chóng)室條件為：27±2℃，RH 50%～70%，L ∶D=14 ∶10。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵選擇的影響

選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)：參考Anforaetal. (2014)、馬艷粉等(2016)的方法，并作一些調(diào)整。取大小相近的馬鈴薯(90±10 g/個(gè))備用。將丹皮酚(paeonol，>99%，武漢遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司)溶解于丙酮中，稀釋成系列濃度(5、1、0.2、0.04或0.008 mg/mL)。吸取200 μL丹皮酚溶液滴于濾紙上，室溫?fù)]發(fā)5 min后，將濾紙放入裝有一個(gè)馬鈴薯的玻璃瓶(6 cm×10 cm)中；另一個(gè)裝有馬鈴薯的玻璃瓶中則放入只滴加溶劑的濾紙作為對(duì)照。玻璃瓶口覆上雙層紗布，作為馬鈴薯塊莖蛾的產(chǎn)卵場(chǎng)所，用塑料蓋蓋上并擰緊(蓋子事先沿邊緣0.5 cm處去掉頂面)，既可露出紗布，滿足瓶?jī)?nèi)物質(zhì)的氣味通過(guò)紗布向外揮發(fā)，又可固定紗布。將瓶蓋外多余的紗布剪掉，用Parafilm封口。將兩個(gè)玻璃瓶沿對(duì)角線放入長(zhǎng)方形容器(36 cm×28 cm×14 cm)中，接入8對(duì)已交配成蟲(chóng)(1日齡)，喂以10%蜂蜜水，容器用紗網(wǎng)(24目)覆蓋。將容器放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，第3天在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)紗布上的落卵量，計(jì)算選擇性產(chǎn)卵忌避指數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)5次。

非選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)：基本方法同上，在容器中放入2個(gè)裝有馬鈴薯以及滴有丹皮酚溶液濾紙的玻璃瓶，另一個(gè)容器中則放入2個(gè)裝有馬鈴薯以及僅滴有溶劑濾紙的玻璃瓶，作為對(duì)照。第 3天在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)紗布上的落卵量，同時(shí)統(tǒng)計(jì)容器壁上的落卵量(吳梅等, 2017)，計(jì)算總落卵量及非選擇性產(chǎn)卵忌避率。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.2丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)的忌避作用

參考Wangetal. (2006)的方法，并有一些調(diào)整。將丹皮酚溶解于丙酮中，稀釋成系列濃度(5、1、0.2、0.04或0.008 mg/mL)。取一張濾紙(φ 7 cm)，用皮帶沖在其中心打下圓形濾紙片(φ 1 cm)，再將濾紙裁成兩半。將一半濾紙浸入丹皮酚溶液中，另一半則浸入丙酮溶液中作為對(duì)照，5 s后取出，室溫?fù)]發(fā)5 min后，將兩半濾紙用雙面膠帶重新粘合在一起，再將事先打下的圓形濾紙片(φ 1 cm)放回原位。將整張濾紙放在玻璃培養(yǎng)皿(φ 7 cm)中，用一圓環(huán)壓在濾紙邊緣，圓環(huán)底邊涂抹凡士林以防幼蟲(chóng)爬出。將10頭初孵幼蟲(chóng)(<6 h)接在中心圓形濾紙片上，放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，10 min后取出，記錄處理與對(duì)照濾紙上的幼蟲(chóng)數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)5次。

為測(cè)試丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)忌避作用的持續(xù)時(shí)間，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取5 mg/mL丹皮酚溶液作為測(cè)試濃度。取一張濾紙(φ 9 cm)，裁去中心直徑為6 cm的圓形，剩下部分浸入丹皮酚溶液中，5 s后取出，室溫?fù)]發(fā)5 min后，放在玻璃培養(yǎng)皿(φ 9 cm)中，再將一張空白濾紙(φ 7 cm)粘在上面。將10頭初孵幼蟲(chóng)(<6 h)接在空白濾紙上，放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，每隔0.5 h記錄仍留在空白濾紙上的幼蟲(chóng)數(shù),并清除已爬出空白濾紙的幼蟲(chóng)，計(jì)算幼蟲(chóng)忌避率。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.3丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲(chóng)的忌避作用

老熟幼蟲(chóng)從馬鈴薯中爬出后，喜歡鉆入沙中化蛹，篩取當(dāng)天爬出的老熟幼蟲(chóng)備用。將丹皮酚溶解于丙酮中，稀釋成系列濃度(25、5、1、0.2或0.04 mg/mL)。取10 g細(xì)沙，滴加200 μL丹皮酚溶液，混勻，細(xì)沙中只滴加200 μL丙酮溶液作為對(duì)照，室溫?fù)]發(fā)10 min，將處理組和對(duì)照組細(xì)沙分別鋪在長(zhǎng)方形容器(16 cm×11 cm×5.5 cm)的兩側(cè)，兩側(cè)細(xì)沙相距8 cm。具容器底面高1 cm處放一具網(wǎng)孔的塑料板(2 mm)，塑料板中央放一內(nèi)壁光滑的塑料圓環(huán)(2 cm×2 cm)，將10頭老熟幼蟲(chóng)接在圓環(huán)中，老熟幼蟲(chóng)自行從孔中鉆入到容器底部，尋找合適場(chǎng)所化蛹。容器用保鮮膜封口，并用昆蟲(chóng)針在保鮮膜上均勻戳孔。將容器放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，24 h后取出，記錄兩側(cè)沙中幼蟲(chóng)及蛹的數(shù)量，處于空白地帶的幼蟲(chóng)或蛹視為無(wú)效。每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.2.4模擬倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)

模擬倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)參考Anforaetal. (2014)的方法，并有一些調(diào)整。實(shí)驗(yàn)在體積為7.5 m3的房間(長(zhǎng)×寬×高=2.1 m×1.7 m×2.1 m)中進(jìn)行，條件為：26±1℃，RH 50%～70%，L ∶D=14 ∶10。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，整個(gè)房間經(jīng)過(guò)清洗并通風(fēng)1周，將通風(fēng)口及門(mén)封以防蟲(chóng)紗網(wǎng)。房間中放3個(gè)木箱(32 cm×32 cm×32 cm)，呈三角形擺放，相距約1 m。在一鐵絲網(wǎng)中央及四角分別懸掛一張濾紙，將1 g丹皮酚溶解在丙酮中，平均滴加在濾紙上，室溫下?lián)]發(fā)5 min后，將鐵絲網(wǎng)架在木箱中，濾紙?jiān)阼F絲網(wǎng)下面，距箱底約5 cm。另一個(gè)房間同樣擺放3個(gè)架有鐵絲網(wǎng)的木箱，濾紙上僅滴加溶劑作為對(duì)照。將18 kg健康馬鈴薯(90±10 g/個(gè))平均分成6份，分別放在上述6個(gè)木箱中的鐵絲網(wǎng)上，每箱約3 kg馬鈴薯(33個(gè))。往房間中接入25對(duì)已交配成蟲(chóng)(1日齡)，將門(mén)關(guān)緊，15 d后檢查馬鈴薯被馬鈴薯塊莖蛾幼蟲(chóng)侵染情況，計(jì)算馬鈴薯受損率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

選擇性產(chǎn)卵忌避指數(shù)(oviposition deterrent index,ODI)按下列公式計(jì)算(Sinthusiri and Soonwera, 2014)：

ODI=落卵量(處理-對(duì)照)/落卵量(處理+對(duì)照)。ODI范圍是-1.0～+1.0，若ODI≤-0.3，表明具有產(chǎn)卵忌避作用，ODI≥+0.3，表明具有產(chǎn)卵引誘作用，ODI=-0.3～+0.3，表明對(duì)產(chǎn)卵無(wú)影響。

非選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)及模擬倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析處理與對(duì)照組間的顯著性差異。非選擇性產(chǎn)卵忌避率按下列公式計(jì)算(呂朝軍等，2015)：非選擇性產(chǎn)卵忌避率(%)=落卵量(處理-對(duì)照)/落卵量(對(duì)照)×100。馬鈴薯受損率按下列公式計(jì)算(Anforaetal., 2014)：

馬鈴薯受損率(%)=被幼蟲(chóng)侵染的馬鈴薯個(gè)數(shù)/馬鈴薯總個(gè)數(shù)×100。

采用χ2檢驗(yàn)分析丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)及老熟幼蟲(chóng)行為影響實(shí)驗(yàn)中處理與對(duì)照組間的顯著性差異(Wangetal., 2006)。幼蟲(chóng)忌避率按下列公式計(jì)算：

幼蟲(chóng)忌避率(%)=空白濾紙上的幼蟲(chóng)數(shù)/總蟲(chóng)量×100。

以上數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵選擇的影響

丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)有顯著產(chǎn)卵忌避作用。在選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)中，5 mg/mL丹皮酚溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的產(chǎn)卵忌避指數(shù)為-0.63，有顯著產(chǎn)卵忌避作用；當(dāng)濃度降低至1 mg/mL以下，對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的產(chǎn)卵選擇無(wú)影響。在非選擇性產(chǎn)卵忌避實(shí)驗(yàn)中，5 mg/mL丹皮酚溶液處理與對(duì)照紗布上的落卵量有極顯著差異(t=11.2,P<0.01)；1 mg/mL濃度下，處理與對(duì)照紗布上的落卵量仍有極顯著差異(t=4.8,P<0.01)；產(chǎn)卵忌避率分別為-89.0%和-46.6%。5 mg/mL丹皮酚溶液處理與對(duì)照間總落卵量有極顯著差異(t=4.7,P<0.01)，表明丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵有抑制作用。(表1、表2)。

表1 選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)中丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵行為的影響Table 1 Dual-choice oviposition deterrent of paeonol on Phthorimaea operculella

表2 非選擇性產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)中丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵行為的影響Table 2 No-choice oviposition deterrent of paeonol on Phthorimaea operculella

2.2 丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)的忌避作用

丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)有顯著忌避作用。5 mg/mL丹皮酚溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)有極顯著忌避作用(χ2=45.3，P<0.01)；濃度降低至1 mg/mL時(shí)，仍保持極顯著忌避作用(χ2=34.4，P<0.01)；濃度降低至0.2 mg/mL以下，處理與對(duì)照之間未顯示出顯著差異。5 mg/mL丹皮酚溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)的忌避作用在0.5 h內(nèi)可保持100%的忌避率，至1 h，忌避率降低至85%左右，之后忌避作用快速降低，1.5 h時(shí)忌避率已降低至50%以下。

圖1 丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)的忌避作用Fig.1 Deterrent effect of paeonol on neogenetic larvae Phthorimaea operculella注：**表示處理與對(duì)照之間差異極顯著P<0.01(χ2檢驗(yàn))。Note：** indicated significantly different at 0.01 level(P<0.01)between treatment and control(χ2 test).

圖2 丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)的忌避時(shí)長(zhǎng)Fig.2 Deterrent duration of paeonol on neogenetic larvae Phthorimaea operculella

2.3 丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲(chóng)的忌避作用

丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲(chóng)有顯著忌避作用。丹皮酚 ∶沙(1 mg ∶2 g)濃度下，處理與對(duì)照之間有顯著差異(χ2=12.8，P<0.05)。濃度降低至丹皮酚 ∶沙(1 mg ∶10 g)以下，處理與對(duì)照之間未顯示出顯著差異。(圖3)。

圖3 丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲(chóng)的忌避作用Fig.3 Deterrent effect of paeonol on mature larvae Phthorimaea operculella注：*表示處理與對(duì)照之間差異顯著P<0.05(χ2檢驗(yàn))。Note：* indicated significantly different at 0.05 level(P<0.05)between treatment and control(χ2 test).

2.4 模擬倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組馬鈴薯的受損率為80.8%，而處理組為23.2%，兩者具有極顯著差異(t=12.7; df=4;P<0.01)，丹皮酚可有效保護(hù)馬鈴薯免受馬鈴薯塊莖蛾為害(圖4)。

圖4 模擬倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)馬鈴薯受損率Fig.4 Percentage of potato tubers damaged by Phthorimaea operculella in the warehouse experiment注：**表示處理與對(duì)照之間差異極顯著P<0.01(t檢驗(yàn))。Note：** indicated significantly different at 0.01 level(P<0.01)between treatment and control(t test).

3 結(jié)論與討論

植物在與植食性昆蟲(chóng)長(zhǎng)期共同進(jìn)化過(guò)程中，形成了以次生代謝產(chǎn)物為主的化學(xué)防御體系，其中植物揮發(fā)性成分是該體系重要的組成之一(Rajendran and Sriranjini, 2008; Campoloetal., 2018)。非寄主植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)往往含有忌避或干擾昆蟲(chóng)行為的化學(xué)物質(zhì)，即使是能被昆蟲(chóng)識(shí)別并準(zhǔn)確定位的寄主植物揮發(fā)物中也可能含有此類物質(zhì)(Anforaetal., 2014)。馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)選擇產(chǎn)卵場(chǎng)所時(shí)能根據(jù)寄主揮發(fā)物區(qū)分完整馬鈴薯和機(jī)械損傷的馬鈴薯，雌蟲(chóng)選擇將卵直接產(chǎn)在完整馬鈴薯上，更有利于幼蟲(chóng)的取食和生存(Arabetal., 2007)。本研究利用紗布作為馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵的場(chǎng)所，消除了觸覺(jué)、視覺(jué)等的干擾因素，測(cè)試了丹皮酚蒸汽對(duì)其產(chǎn)卵選擇的影響，結(jié)果表明，丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵有顯著忌避作用，而且高濃度丹皮酚對(duì)雌蟲(chóng)產(chǎn)卵有抑制作用，這意味著丹皮酚會(huì)干擾馬鈴薯塊莖蛾對(duì)產(chǎn)卵場(chǎng)所的選擇，減少直接產(chǎn)在寄主馬鈴薯上的卵量，同時(shí)減少總產(chǎn)卵量。馬鈴薯塊莖蛾在倉(cāng)庫(kù)環(huán)境下一年可發(fā)生多個(gè)世代，存在不同蟲(chóng)態(tài)交疊的情況，故本研究同時(shí)考察了丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲(chóng)及老熟幼蟲(chóng)的忌避作用，結(jié)果表明丹皮酚對(duì)上述兩種蟲(chóng)態(tài)均有顯著忌避作用。模擬倉(cāng)貯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了丹皮酚對(duì)馬鈴薯的保護(hù)作用，結(jié)果表明在丹皮酚蒸汽的保護(hù)下，馬鈴薯的受損率由80.8%降低至23.2%。

應(yīng)用“Push-Pull”策略防治馬鈴薯塊莖蛾蟲(chóng)害，需要“忌避劑”與“引誘劑”的配合才能更好的發(fā)揮防治作用，丹皮酚與已知“引誘劑”的組合研究尚未開(kāi)展；此外，丹皮酚的忌避作用與其濃度直接相關(guān)，植物揮發(fā)物具有對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低、易降解、殘留低等優(yōu)點(diǎn)，但其應(yīng)用受到沸點(diǎn)高、蒸氣壓低等物理性質(zhì)的限制(Rajendran and Sriranjini, 2008)，如何保持丹皮酚有效的熏蒸濃度及忌避時(shí)長(zhǎng)？該問(wèn)題的解決還需今后開(kāi)展其制劑相關(guān)研究。

丹皮酚對(duì)馬鈴薯塊莖蛾雌蟲(chóng)產(chǎn)卵選擇及幼蟲(chóng)均具有顯著忌避作用，是馬鈴薯倉(cāng)貯期馬鈴薯塊莖蛾蟲(chóng)害防治的又一有潛力的植物源忌避劑，進(jìn)一步拓寬了丹皮酚在蟲(chóng)害防治領(lǐng)域的應(yīng)用。