崔國良，馮小可，魏睦新，蔣金桃，林貞妍，謝立群

1.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，江蘇 南京 210029

糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)是以非梗阻性胃排空延遲為主要特征的胃動力障礙性疾病，其發(fā)病率及患病人數(shù)逐年增加。有研究顯示[1]，約5%的糖尿病患者都伴有胃排空延遲。DGP嚴(yán)重影響患者對食物的消化及對藥物的吸收，加重糖脂代謝紊亂，使血糖及病情難以控制[2]。因此，如何有效改善DGP患者的胃動力并探究其相關(guān)的作用機制十分重要。

DGP發(fā)病機制較為復(fù)雜，包括胃腸激素紊亂、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of cajal，ICC)損傷、胃腸神經(jīng)病變和微血管損傷等[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療在控制血糖的基礎(chǔ)上，選擇促胃動力等藥物對癥治療，但長期服用會導(dǎo)致其療效降低及不良事件的風(fēng)險增加[4]。DGP屬于中醫(yī)“消渴病，痞滿，嘔吐”等范疇，治療原則為化濕降濁、和胃益脾[5]。香砂六君湯是益氣健脾、和胃除痞的經(jīng)典方劑，能明顯改善DGP患者的胃腸癥狀[6-7]。半夏瀉心湯主治寒熱錯雜之痞證，能有效促進胃動力[8-9]，其作用機制與增加ICC的數(shù)量并修復(fù)其受損超微結(jié)構(gòu)[10]、改善胃腸激素分泌紊亂等相關(guān)[11]。兩方相合，經(jīng)適當(dāng)加減，用于治療DGP有良好的療效[12-13]，故成為本實驗所選的組方，但其治療DGP的相關(guān)作用機制尚不清楚。課題組前期應(yīng)用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)多種代謝產(chǎn)物含量的變化與DGP的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]。因此，本實驗應(yīng)用血清代謝組學(xué)的方法，分析香砂六君合半夏瀉心湯對DGP大鼠的血清代謝產(chǎn)物的影響，以進一步闡明其治療DGP的相關(guān)作用機制。

1 材料

1.1 動物清潔級雄性SD大鼠50只，5～6周齡，體質(zhì)量(180±20) g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證：SYXK(蘇)2016-0016，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，倫理批號：IACUC-1804013。

1.2 藥物及試劑香砂六君合半夏瀉心湯(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：164285)；莫沙必利片(江蘇豪森藥業(yè)有限公司，批號：203542)。鏈脲佐菌素、甲氧胺、吡啶、N，O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(美國Sigma公司，批號分別為：S0130，BCBN2932V，STBD3575V，BCBS4254V)；正乙烷(美國ROE公司中，批號：4A6004)；甲醇(德國Merck公司，批號：7880707710)。

1.3 儀器Trace 1310/TSQ 8000型號氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TG-5MS型毛細(xì)管色譜柱、Speed-vac型真空離心濃縮儀(美國Thermo公司)；Allegra64R型低溫度速離心機、Allegra X-15R型冷凍離心機(美國Beckman公司)；TH恒溫振蕩器(蘇州太倉布強樂實驗設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 建立DGP大鼠模型大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁水2 h后，造模大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(80 mg·kg-1，溶解在 0.1 mol·L-1的枸櫞酸鹽緩沖液中，現(xiàn)配現(xiàn)用)及高脂飼料喂養(yǎng)8周[17-18]；正常組大鼠給予等劑量的緩沖液腹腔注射及常規(guī)飼料喂養(yǎng)8周。DGP大鼠模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為：血糖值大于16.7 mmol·L-1，且胃殘留率較正常組明顯升高。

2.2 分組與給藥將造模成功的大鼠隨機分為模型組、莫沙必利(1.56 mg·kg-1)組和香砂六君合半夏瀉心(9.3 g·kg-1)組，每組10只。各組給予相應(yīng)的藥物正常組、模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥8周。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 檢測胃殘留率大鼠禁水2 h后，給予2 mL的5%酚紅溶液灌胃，20 min后麻醉，取胃，加入生理鹽水將胃內(nèi)容物定容為20 mL，經(jīng)堿化顯色及除去蛋白質(zhì)后，3 500 r·min-1離心5 min，于 560 nm 波長下測定吸光度(OD)值。將0.5%酚紅溶液重復(fù)上述堿化、除去蛋白質(zhì)及測定吸光度等步驟后，并將所測定的值標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)酚紅OD值。

大鼠胃殘留率=(實測酚紅OD值/標(biāo)準(zhǔn)酚紅OD值)×100%

2.3.2 采集血清樣本大鼠麻醉后腹主動脈取血，離心(4 ℃，3 500 r·min-1，15 min)后取血清，-20 ℃保存待測。

2.4 代謝組學(xué)的檢測方法

2.4.1 血清樣品前處理取50 μL血清于離心管，加入200 μL甲醇溶液 (含12.5 μg·mL-113C標(biāo)記的肉豆蔻酸)，渦旋3 min，離心(4 ℃、14 000 r·min-1)10 min。取上清100 μL，揮干后加入30 μL甲氧胺吡啶，恒溫振蕩后加入30 μL的BSTFA，渦旋5 min后再次恒溫振蕩，結(jié)束后將樣品離心(4 ℃、18 000 r·min-1)10 min，取上清進行上機進樣。

2.4.2 質(zhì)控(QC)樣本制備從24份血清樣本(每組6個樣本)中各吸取10 μL并混合均勻，得到血清質(zhì)控樣本，吸取50 μL重復(fù)“2.4.1”中的操作。

2.4.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件樣品分析使用GC-MS (Trace 1310/TSQ 8000)，在TG-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱上進行分離。載氣為氦氣，流速：1.2 mL·min-1；進樣口溫度：300 ℃，傳輸線溫度：290 ℃；采用程序升溫：60 ℃保持1 min，13 min后溫度升至320 ℃，最后以320 ℃的溫度保持5 min；儀器配EI離子源，離子源溫度：300 ℃；采用全掃描模式，掃描范圍：50～500，質(zhì)譜采集時間：3.8 min～19 min；樣品分析采用隨機進樣的方式，進樣量：1 μL。

2.4.4 穩(wěn)定性考察采用“2.4.2”中的QC樣本對分析方法進行考察，在正式實驗前首先進兩針QC樣本，隨后上機檢測，每6個血清實驗樣品加入1個血清QC樣本。通過QC樣本在PCA得分圖上的聚合度評價分析方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

2.4.5 數(shù)據(jù)處理將GC-MS采集的圖譜信息進行峰提取及物質(zhì)鑒定后，進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，并以 VIP>1.0和Fold Change>1.5或<0.67為篩選條件獲得差異性物質(zhì)。采用Metaboanalyst 4.0 (http：//www.metaboanalyst.ca)進行差異代謝物的代謝網(wǎng)絡(luò)分析。

3 結(jié)果

3.1 香砂六君合半夏瀉心湯對DGP大鼠胃殘留率的影響與正常組比較，模型組的胃殘留率顯著升高(P<0.01)，表明DGP大鼠模型建立成功；與模型組比較，香砂六君合半夏瀉心湯組和莫沙必利組的胃殘留率明顯降低(P<0.05)，提示經(jīng)過藥物干預(yù)后大鼠的胃排空明顯加快，胃殘留率降低。見表1。

表1 香砂六君合半夏瀉心湯對DGP大鼠胃殘留率的影響

3.2 大鼠血清GC-MS分析總離子流圖在負(fù)離子模式下，對各組大鼠血清樣品進行GC-MS技術(shù)檢測后，獲得血清總離子流圖。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，各組大鼠血清樣本總離子流圖中的峰型和數(shù)量具有一定的差異。見圖1。

注：A為正常組；B為模型組；C為莫沙必利組；D為香砂六君合半夏瀉心湯組

3.3 方法學(xué)驗證將QC樣本與所有血清樣本進行PCA分析，與實驗樣本比較，QC樣本在PCA圖較為集中，說明儀器相對穩(wěn)定，可進行下一步實驗分析。見圖2。

圖2 血清QC樣本和所有血清樣本的PCA圖

3.4 大鼠血清樣本GC-MS分析PLS-DA得分圖每個點代表一個樣本，所有樣本點均分布在95%置信區(qū)間。從血清樣本PLS-DA得分圖可知，正常組、模型組和香砂六君合半夏瀉心湯組間的代謝輪廓能明顯區(qū)分，且分離程度好，提示經(jīng)香砂六君合半夏瀉心湯干預(yù)治療后，DGP大鼠血清代謝輪廓向正常組靠近，表明內(nèi)源性代謝紊亂有所改善。見圖3。

注：綠色為正常組，藍(lán)色為模型組，黃色為莫沙必利組，紅色為香砂六君合半夏瀉心湯組

3.5 差異性代謝物的篩選根據(jù)構(gòu)建的PLS-DA模型的變量投影重要性(variable importance in the projection，VIP)，篩選出VIP值大于1的代謝產(chǎn)物，然后根據(jù)Fold Change>1.5或<0.67篩選正常組與模型組、模型組與香砂六君合半夏瀉心湯組血清樣本中有顯著性差異的代謝產(chǎn)物。篩選出正常組與模型組之間的差異代謝產(chǎn)物33種，見表2。其中葡萄糖-1-磷酸、N-乙酰基-L-天冬氨酸、脯氨酸等的含量差異倍數(shù)較大，這些代謝產(chǎn)物可能是模型大鼠發(fā)病過程中血清中關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物。香砂六君合半夏瀉心湯可通過回調(diào)其中13個代謝產(chǎn)物改善模型大鼠血清代謝輪廓，見表3。

3.6 代謝物通路分析將正常組與模型組、模型組與香砂六君合半夏瀉心湯組血清樣本中篩選得到的差異性代謝物進行MetaboAnalyst 4.0代謝通路分析，以通路影響值>0.1作為篩選條件，正常組與模型組之間共篩選得到3條相關(guān)代謝通路，見圖4和表4。模型組與香砂六君合半夏瀉心湯組之間共篩選得到2條相關(guān)代謝通路，見圖5和表5。

注：1.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；2.淀粉和蔗糖代謝；3.精氨酸和脯氨酸代謝

注：1.戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化；2.硒復(fù)合代謝

表2 正常組與-模型組之間血清樣本差異性代謝產(chǎn)物

表3 香砂六君合半夏瀉心湯對模型大鼠血清樣本中差異代謝產(chǎn)物的影響

表4 正常組與模型組血清樣本差異代謝物通路富集分析結(jié)果

表5 模型組與香砂六君合半夏瀉心湯組血清樣本差異代謝物通路富集分析結(jié)果

4 討論

代謝組學(xué)主要通過定量、無創(chuàng)傷地分析體液如尿液、血液和唾液等，來識別和測定由于內(nèi)部或外部環(huán)境刺激的整個機體代謝的應(yīng)答反應(yīng)，從而確定特定的潛在生物標(biāo)志物或代謝途徑，被廣泛用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究[19]，尤其是對于中藥治療相關(guān)疾病的研究，可從現(xiàn)代科學(xué)的層面對其作用機制進行分析和驗證[20]。質(zhì)譜技術(shù)分析是代謝組學(xué)最常用的技術(shù)，數(shù)據(jù)分析是代謝組學(xué)研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]。因此，本實驗采用 GC-MS 技術(shù)檢測各組大鼠的血清樣本，并采用多元模式方法分析血清中差異代謝物及其相關(guān)的代謝通路，初步探討香砂六君合半夏瀉心湯治療DGP的相關(guān)作用機制和代謝途徑。

N-乙酰天門冬氨酸(N-acetylaspartate，NAA)是判別神經(jīng)元損傷嚴(yán)重程度的一項生化指標(biāo)[22]，目前對于NAA的研究多集中于卒中后的代謝變化[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，NAA在糖尿病大鼠腦區(qū)的代謝含量有顯著變化[25]。本實驗結(jié)果顯示，香砂六君合半夏瀉心湯對DGP大鼠血清中的NAA含量具有明顯的回調(diào)作用，而神經(jīng)元病變作為DGP的重要發(fā)病機制之一，提示香砂六君合半夏瀉心湯可能有一定保護胃腸神經(jīng)元的作用，從而維持正常的胃排空。

葡萄糖-1-磷酸是糖代謝的中間產(chǎn)物[26]；塔格糖是果糖的一種“差向異構(gòu)體”；D-半乳糖是乳糖水解后的一種右旋六碳醛糖；木糖醇是正常糖類代謝的中間體，葡萄糖的1位醛基氧化為羧基后轉(zhuǎn)變葡萄糖酸；甘露醇是山梨糖醇的同分異構(gòu)體；異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷是β-半乳糖苷酶和β-半乳糖透酶的誘導(dǎo)劑及硫代半乳糖轉(zhuǎn)酰酶的底物，其含量增加可能與乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘呛推咸烟堑乃较嚓P(guān)；尿嘧啶是RNA特有的堿基，亦含于二磷酸尿苷葡糖等生成多糖的重要的前體中。有研究表明[27]，糖尿病大鼠血清中尿嘧啶含量升高，與本研究結(jié)果相一致。這些差異性代謝產(chǎn)物均為葡萄糖在體內(nèi)代謝過程中的產(chǎn)物或與代謝有關(guān)的物質(zhì)，其含量在模型組中均明顯升高，而經(jīng)藥物治療后，這些產(chǎn)物的含量較模型組下降。因此，香砂六君合半夏瀉心湯可能有一定的改善糖代謝等作用。脯氨酸為生糖氨基酸，可通過糖異生途徑合成葡萄糖，同時也是組成動物膠原蛋白的重要成分，在生物體內(nèi)發(fā)揮著滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的作用，還可作為細(xì)胞膜和酶的保護物質(zhì)以及自由基清除劑[28]。本實驗結(jié)果顯示，模型組脯氨酸的含量較正常組降低了近5倍，而香砂六君合半夏瀉心湯組較模型組又幾乎升高了5倍，提示香砂六君合半夏瀉心湯有強大的保護脯氨酸不被降解的作用，推測其在DGP中可能發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的滲透平衡的作用。

綜上所述，香砂六君合半夏瀉心湯對DGP大鼠有一定改善胃動力作用。本研究運用代謝組學(xué)分析香砂六君合半夏瀉心湯對DGP大鼠血清中的代謝產(chǎn)物的干預(yù)作用發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠的血清代謝輪廓與DGP大鼠具有明顯差異，并篩選出33個生物標(biāo)記物；香砂六君合半夏瀉心湯通過作用戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、硒復(fù)合代謝通絡(luò)，從而改善DGP大鼠血清代謝產(chǎn)物的含量紊亂，從而促進胃排空。分析差異性代謝產(chǎn)物和代謝通路有利于進一步研究DGP的發(fā)病機制，并為中醫(yī)藥防治DGP提供重要的理論依據(jù)。