宋嗣恩，覃月秋，黃贊松，周喜漢

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是消化內(nèi)科常見的急危重癥，約占急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)20%，該病起病兇險、并發(fā)癥多、治療費用高、預(yù)后差、病死率高[1-2]。臨床上SAP的早期表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，晚期常因繼發(fā)感染導致多器官功能障礙(multiple organ dysfunction，MODS)。有研究發(fā)現(xiàn)淋巴細胞凋亡異常導致機體免疫失衡是SAP患者繼發(fā)感染及膿毒癥的重要原因[3]，但其分子機制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)[4]，而IRE1是否參與SAP淋巴細胞凋亡的調(diào)節(jié)文獻報道較少。為明確IRE1在大鼠SAP淋巴細胞凋亡中的作用，本研究應(yīng)用逆行胰膽管注射?；悄懰徕c誘導SD大鼠SAP動物模型，RT-qPCR檢測脾臟淋巴細胞IRE1 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達情況，流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞凋亡，初步探討IRE1對SAP大鼠脾淋巴細胞凋亡的作用，為闡明SAP機體免疫失衡機制，尋找干預(yù)和治療SAP新靶點，提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 20只體重控制在250～300 g的成年SD大鼠，?；悄懰徕c(美國Sigma)；大鼠淀粉酶和脂肪酶測定試劑盒(北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司) ；總RNA提取試劑盒(上海閃晶分子生物科技有限公司)；Fastking RT Kit(上海閃晶分子生物科技有限公司)； SYBR Green(上海閃晶分子生物科技有限公司)；PCR引物IRE1、 Caspase-3合成(上海捷倍思基因技術(shù)有限公司)；Anti- IRE1抗體、Anti-Caspase-3抗體(默克生命科學)；紫外分光光度計；羅氏LightCycler96實時熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 采用隨機數(shù)字表法將20只大鼠隨機分為假手術(shù)組(SO組)、SAP組，每組10只。SO組大鼠僅開腹翻動胰腺后關(guān)腹，SAP組大鼠在胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c0.1 ml/100 g構(gòu)建SAP模型[5]。

1.2.2 胰腺組織病理學及評分 按照Schmidt評分細則及方法[6]，胰腺組織石蠟包埋，超薄切片機切成4微米/片，HE染色后，采用雙盲法，轉(zhuǎn)顯微鏡下由兩名病理醫(yī)生進行閱片評分，隨機選取5個400×視野/片，進行觀察以下4種病理狀態(tài)：①水腫(edema)；②出血(hemorrhage)；③壞死(necrosis)；④炎癥浸潤(inflammatory infiltration)，這4種病理狀態(tài)作為病理損傷嚴重程度評分的參考依據(jù)，逐一進行評分，并做好記錄。

1.2.3 淀粉酶和脂肪酶檢測方法 按照大鼠淀粉酶和脂肪酶檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4 脾臟淋巴細胞分離 研磨脾臟組織，制備脾臟組織單細胞懸液，加1×PBS或1640無血清培養(yǎng)液3 ml按照1∶1 比例稀釋；混勻，37℃水浴中平衡，吸取脾臟組織單細胞懸液至淋巴細胞分離液液面上，置于20℃，2000 r/min水平離心機離心20 min，吸取乳白色淋巴細胞層，加入15 ml離心管中，然后加入細胞洗滌液10 ml，混勻細胞，離心10 min(轉(zhuǎn)速1500 r/min)，倒掉上清液，重復(fù)操作本步驟一次。將重懸的細胞轉(zhuǎn)移到平皿中， 5%CO2培養(yǎng)箱中設(shè)定溫度37℃，進行培養(yǎng)60 min，待單核細胞貼壁后，收集所需的淋巴細胞懸液。

1.2.5 RT-qPCR檢測 IRE1 mRNA、Caspase-3 mRNA表達內(nèi)參β-actin引物序列：F5′-GGGAATGGGTCAGAAGGACT-3′，R5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′。IRE1序列：F5′-GGACTGCCTGGGTCTTTGAT-3′，R5′-TGTGGGGTCAAACGCCTATT-3′。Caspase-3序列：F5′-CTAGCTCCTAGTCTCTGCTCCC-3′，R5′-TCCGTCCCCAATACGTGTCGAATGCA-3′。按照操作說明書，分別提取各組脾臟組織的總RNA，采用紫外分光光度計檢測OD260、OD280其濃度。抽取2 μg總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，將其存入-80℃冰箱。采用SYBR Green擴增cDNA，并使用PCR儀檢測。以β-actin分析IRE1和Caspase-3的mRNA表達水平。每組設(shè)3個復(fù)孔進行對照，利用2-△△CT法計算IRE1及 Caspase-3的mRNA相對表達量。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞凋亡 分離好的淋巴細胞懸液，采用低溫PBS重復(fù)洗滌細胞，細胞用1×Binding Buffer調(diào)為1×106/ml，吸取100 μl淋巴細胞懸液轉(zhuǎn)移至5 ml流式管中，各加入5 μl PI 和5 μl AnnexinV-FITC，緩慢混勻細胞懸液，孵育(條件為：室溫25℃，避光15 min)，將400 μl 1×Binding Buffer加入每個流式管，上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胰腺病理評分 SO組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰，無明顯水腫，偶有炎性細胞浸潤；SAP組胰腺腺泡高度水腫，出現(xiàn)腺泡結(jié)構(gòu)的破壞，可見間質(zhì)內(nèi)的紅細胞滲出和出血、壞死，血管損傷或血栓形成， 間質(zhì)水腫，間隔模糊變寬，炎癥反應(yīng)明顯，可見脂肪壞死，導管擴張，腺泡細胞萎縮。按照Schmidt評分細則，SAP組與SO組比較，胰腺病理組織學評分顯著性增加，見表1。

表1 大鼠胰腺病理組織損傷評分

2.2 大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平 SAP組中大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平含量均顯著升高，與SO組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶水平含量 單位：U/L

2.3 大鼠脾臟淋巴細胞IRE1、Caspase-3 mRNA相對表達量 SO組大鼠脾臟淋巴細胞中IRE1 、Caspase-3 mRNA相對表達量呈低表達，SAP組大鼠中IRE1 mRNA相對表達量顯著升高，與SO組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：與SO組相比較，*：P<0.05。

2.4 流式細胞術(shù)檢測大鼠脾淋巴細胞凋亡情況 使用二維散點圖表示大鼠脾淋巴細胞凋亡率，以Annexin-V FITC為橫坐標，PI為縱坐標，以陰性對照、PI單染管和FITC單染管設(shè)定界限，把淋巴細胞分成：正?；罴毎?左下象限Q4，Annexin-V FITC-、PI-)；早期凋亡細胞(右下象限Q3，Annexin-V FITC+、PI-)；死亡細胞(右上象限Q2，Annexin-V FITC+、PI+)。SAP組脾淋巴細胞凋亡率與SO組比較，脾淋巴細胞凋亡率升高(P<0.001)，見表3、圖2。

表3 實驗大鼠脾血淋巴細胞凋亡率

2.5 SAP大鼠脾淋巴細胞中IRE1與Caspase-3 mRNA相對表達量相關(guān)分析 SAP組中脾臟淋巴細胞IRE1 mRNA與脾臟淋巴細胞Caspase-3 mRNA相對表達量呈正相關(guān)(r=0.884，P<0.05)，提示脾臟淋巴細胞IRE1 mRNA表達增高，脾臟淋巴細胞Caspase-3 mRNA水平隨之上升，見圖3。

2.6 SAP大鼠脾淋巴細胞中IRE1 mRNA表達與凋亡率的相關(guān)分析 SAP組中脾臟淋巴細胞IRE1 mRNA與脾臟淋巴細胞凋亡率呈正相關(guān)(r=0.875，P<0.05)，顯示脾淋巴細胞中IRE1表達的增高，脾臟淋巴細胞凋亡率升高，見圖4。

3 討論

SAP是由胰腺的局部炎癥引發(fā)嚴重的全身多器官損害的疾病，它主要以致命的MODS和SIRS為特征[7]。盡管臨床上大部分的SAP患者能夠得到及時診斷和必要的治療，但治療手段和方法的選擇仍然十分有限[8]。目前，SAP仍然是一個高發(fā)病率和死亡率的消化系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計僅在歐洲SAP患者死亡率甚至高達44%[9]。AP首先從無菌的局部炎癥開始，誘發(fā)SIRS，然后是代償性抗炎反應(yīng)綜合征(compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS)，有相關(guān)研究表明在SAP小鼠中SIRS和CARS可并行發(fā)展[10]，最終導致機體免疫抑制。SAP初期始于胰腺組織的局部炎癥，可導致多種胰腺外器官功能障礙的發(fā)生，然而，潛在的機制仍不清楚[11]。研究表明淋巴細胞大量凋亡導致SAP患者淋巴細胞亞群減少，是影響機體產(chǎn)生免疫抑制的重要因素[5，12]。我們采用流式細胞術(shù)檢測SAP大鼠脾淋巴細胞凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SAP淋巴細胞凋亡率增高，與前人的研究結(jié)果一致[13-14]，提示機體免疫功能受損。

SO組

SAP組

圖3 SAP大鼠脾淋巴細胞中IRE1與Caspase-3mRNA表達水平的相關(guān)性

圖4 SAP大鼠脾淋巴細胞中IRE1與凋亡率的相關(guān)性

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是新近研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路[15]。細胞應(yīng)激是AP等胰腺疾病發(fā)生的先決條件，當細胞受到刺激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生紊亂，且堆積著大量的錯誤/未折疊蛋白質(zhì)，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)以保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。但持續(xù)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘發(fā)炎癥，嚴重時可致細胞凋亡，且與AP的細胞凋亡存在顯著關(guān)系[16]。越來越多的證據(jù)表明ERS是損傷胰腺腺泡細胞的早期反應(yīng)，是AP的發(fā)病機制之一[15]。

IRE1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號途徑，是啟動的觸發(fā)UPR的最保守的途徑[17]。有文獻報道AP通過IRE1通路激活胰腺的ERS，IRE1、 XBP1 mRNA和蛋白水平顯著升高[4]，而ERS可能通過胰腺腺泡細胞凋亡導致實質(zhì)損傷[18]。IRE1α內(nèi)切酶是ERS的關(guān)鍵調(diào)控因子，控制著腫瘤細胞的存活和凋亡。抑制IRE1α內(nèi)切酶可導致剪接XBP1的減少，從而降低癌細胞的增殖，增加細胞的死亡[19]。通過抑制自適應(yīng)的UPR反應(yīng)信號通路，IRE1還激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路，促進細胞死亡和胰腺炎[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)SAP大鼠脾淋巴細胞IRE1表達明顯升高，提示SAP時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1途徑激活，IRE1可能參與SAP的發(fā)病，這與Jia G等[21]在其他動物身上的研究結(jié)論相符，但是否與淋巴細胞凋亡相關(guān)尚不明確，因此我們進一步檢測了脾淋巴細胞Caspase-3表達，并進行了相關(guān)研究。

為明確IRE1與SAP淋巴細胞凋亡的關(guān)系，我們做了IRE1與Caspase-3表達及淋巴細胞凋亡率相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SAP組中脾臟淋巴細胞中IRE1 mRNA表達增高，同時脾臟淋巴細胞Caspase-3 mRNA水平及淋巴細胞凋亡率亦升高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，脾臟淋巴細胞IRE1 mRNA表達水平與Caspase-3 mRNA表達水平呈正相關(guān)，IRE1 mRNA與淋巴細胞凋亡率呈正相關(guān)。綜合以上分析， IRE1高表達，有可能是在SAP中導致淋巴細胞凋亡增加的重要原因。淋巴細胞是一種重要的炎性細胞，其表達水平通常代表著炎癥水平的高低。在SO組中，淋巴細胞的比例低，凋亡水平低，正說明了SO組中淋巴細胞處于一個良性的循環(huán)中。相反，淋巴細胞在SAP組中的高表達與高凋亡，說明了淋巴細胞的生成與因抗炎所致的凋亡，處于一個高速的循環(huán)之中。由于淋巴細胞能分泌諸多炎性因子，炎性因子在SAP患者體內(nèi)的蓄積，可導致“炎癥風暴”的產(chǎn)生，這是胰腺炎患者死亡最常見的原因之一[22-23]。因此通過調(diào)控IRE1的表達，干預(yù)淋巴細胞的凋亡，減少炎癥因子的釋放可能是SAP的一個新的治療思路。