王峰 劉國(guó)強(qiáng) 潘浩 季文輝△

骨肉瘤(OS)是一種起源于間充質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤[1]。近些年患者的發(fā)病率明顯降低，然而病人會(huì)出現(xiàn)不同程度的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此深入探討骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。微小RNA是一類非編碼RNA，可以誘導(dǎo)信使RNA的降解和翻譯、抑制、調(diào)節(jié)促癌基因或者抑癌基因的表達(dá)，研究表明miRNA-363具有抑制骨肉瘤的作用[2]，有文獻(xiàn)報(bào)道HNF1A-AS1可以通過(guò)激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[3]，HNF1A-AS1可以通過(guò)靶向調(diào)控miRNA實(shí)現(xiàn)其促癌作用[4]。黃連素為一種異喹啉類生物堿，能夠調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和淋巴免疫等，具有抗腫瘤作用，如黃連素可以在體外抑制肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。然而有關(guān)黃連素與骨肉瘤之間的關(guān)系尚不明了，因此本研究主要分析黃連素通過(guò)LncRNA HNF1A-AS1調(diào)控miRNA-363對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)方法

將培養(yǎng)在DMEM中(37 ℃，5% CO2)的處于生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞分為對(duì)照組、黃連素組、黃連素+HNF1A-AS1組和HNF1A-AS1組。黃連素+HNF1A-AS1組和HNF1A-AS1組轉(zhuǎn)染HNF1A-AS1 pcDNA 3.1質(zhì)粒，根據(jù)制造商的說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的比例加入細(xì)胞和質(zhì)粒載體，在24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)[5]，黃連素組、黃連素+HNF1A-AS1組在培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μmol/L的黃連素，培養(yǎng)48 h。

1.2 主要材料和儀器

人OS細(xì)胞系U2OS(ATCC公司，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國(guó))；HNF1A-AS1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及相應(yīng)的陰性對(duì)照(Negative Control，NC)(Thermo Fisher公司，美國(guó))；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國(guó))；PCR引物由Genewiz公司(中國(guó))設(shè)計(jì)和合成；Trizol試劑(Invitrogen公司，美國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒(Roche公司，瑞士)；MiScript試劑盒和MiScript SYBR-Green PCR試劑盒(QIAGEN公司，德國(guó))；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)試劑盒和結(jié)晶紫染色試劑盒(Beyotime生物技術(shù)研究所，中國(guó))；凋亡檢測(cè)試劑盒和FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀(BD Biosciencesg公司，美國(guó))；Transwell小室(Becton Dickinson公司，美國(guó))；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；pMIR-REPORT熒光素酶載體(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))和分析系統(tǒng)(Promega，美國(guó))；雙熒光霉素報(bào)告基因分析系統(tǒng)(Promega公司，美國(guó))。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1qPCR檢測(cè)HNF1A-AS1水平 通過(guò)Trizol獲得細(xì)胞中總RNA并檢測(cè)濃度和純度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(在95 ℃下10 min，40個(gè)循環(huán)，94 ℃下15 s，60 ℃/1 min，60 ℃下1 min，4 ℃保存)。以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)比較循環(huán)閾值分析HNF1A-AS1的表達(dá)。

1.3.2CCK-8檢測(cè)增殖 將100 μL含有1×104個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞溶液接種于96孔板，在培養(yǎng)第48 h加入10 μL CCK-8試劑并在37 ℃下孵育10 min，檢測(cè)通過(guò)酶標(biāo)儀450 nm處的吸光度(OD)值。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 將1×106個(gè)細(xì)胞使用不含EDTA的0.25%胰酶消化，然后分別用預(yù)冷的PBS和5%牛血清白蛋白洗滌3次，離心收集細(xì)胞(2 000 r/min)，加入100 μL結(jié)合緩沖液和5 μL的Annexin-V-FITC(20 μg/mL)靜置15 min在黑暗中孵化，然后加入150 μL結(jié)合緩沖液和10 μL的PI(50 μg/mL)靜置15 min在黑暗中孵化，通過(guò)FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀測(cè)量凋亡率。

1.3.4Transwell檢測(cè)侵襲 在Transwell小室的上部腔室和下部腔室中分別添加基質(zhì)膠和完全培養(yǎng)基，將1×104個(gè)細(xì)胞在上室中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)過(guò)程中有侵襲能力的細(xì)胞會(huì)進(jìn)入下室，將侵入的細(xì)胞用20%甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野中侵入底部室的細(xì)胞數(shù)目的平均值。

1.3.5qPCR檢測(cè)miRNA-363b表達(dá) 根據(jù)1.3.1節(jié)的方法獲得總RNA，通過(guò)MiScript試劑盒合成互補(bǔ)DNA，并將MiScript SYBR-Green PCR試劑盒用于qPCR，使用U6作為內(nèi)參。

1.3.6雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證HNF1A-AS1靶向miRNA-363 將野生型(Wt)/突變(Mut)HNF1A-AS1和miRNA-363模擬物分別克隆到pMIR-REPORT中，然后分別將miRNA-363 NC/mimic以及Wt/Mut-HNF1A-AS1轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，然后使用雙熒光霉素報(bào)告基因分析系統(tǒng)評(píng)估熒光霉素活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)OS細(xì)胞中HNF1A-AS1的影響

由表1可知，黃連素組的HNF1A-AS1水平顯著低于對(duì)照組，表明黃連素能夠抑制OS細(xì)胞中HNF1A-AS1表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.436，P=0.011 0，P<0.05)；HNF1A-AS1組HNF1A-AS1水平高于對(duì)照組，表明HNF1A-AS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.203，P=0.018 7，P<0.05)；和黃連素+HNF1A-AS1組比較，黃連素組HNF1A-AS1水平明顯降低，HNF1A-AS1組HNF1A-AS1水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.085，P=0.036 6，P<0.05)，結(jié)果表明黃連素能夠降低OS細(xì)胞內(nèi)HNF1A-AS1表達(dá)。

表1 各轉(zhuǎn)染組HNF1A-AS1水平比較

2.2 黃連素通過(guò)HNF1A-AS1對(duì)OS細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，與對(duì)照組比較，黃連素組的OD值降低，HNF1A-AS1組的OD值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.800，P=0.016 0，P<0.05)；和黃連素+HNF1A-AS1組相比，黃連素組細(xì)胞OD值明顯降低，HNF1A-AS1組OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.304，P=0.018 2，P<0.05)，結(jié)果表明黃連素可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1表達(dá)來(lái)抑制OS細(xì)胞的增殖。

表2 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD值比較

2.3 黃連素通過(guò)HNF1A-AS1對(duì)OS細(xì)胞凋亡的影響

由表3可知，與對(duì)照組比較，黃連素組細(xì)胞凋亡率升高，HNF1A-AS1組的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.656，P=0.021 8，P<0.05)；與黃連素+HNF1A-AS1組相比，黃連素組細(xì)胞凋亡率明顯升高，HNF1A-AS1組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.037，P=0.0264，P<0.05)，結(jié)果表明黃連素可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1表達(dá)來(lái)促進(jìn)OS細(xì)胞的凋亡。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.4 黃連素通過(guò)HNF1A-AS1對(duì)OS細(xì)胞侵襲的影響

由圖1和表4可知，與對(duì)照組比較，黃連素組細(xì)胞侵襲數(shù)目降低，HNF1A-AS1組細(xì)胞侵襲數(shù)目升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.882，P=0.039 5，P<0.05)；與黃連素+HNF1A-AS1組相比，黃連素組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少，HNF1A-AS1組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.045，P=0.026 3，P<0.05)，結(jié)果表明黃連素可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1表達(dá)來(lái)抑制OS細(xì)胞的侵襲。

表4 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

(紫色為被染色的具有侵襲能力的細(xì)胞，細(xì)胞侵襲數(shù)目排序：HNF1A-AS1組>黃連素+HNF1A-AS1組>對(duì)照組>黃連素組)

2.5 黃連素通過(guò)HNF1A-AS1對(duì)OS細(xì)胞中miRNA-363表達(dá)的影響

由表5可知，與對(duì)照組比較，黃連素組細(xì)胞內(nèi)miRNA-363表達(dá)水平升高，HNF1A-AS1組的miRNA-363表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.207，P=0.018 7，P<0.05)；與黃連素+HNF1A-AS1組相比，黃連素組細(xì)胞miRNA-363表達(dá)水平明顯升高，HNF1A-AS1組細(xì)胞miRNA-363表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.475，P=0.017 4，P<0.05)，結(jié)果表明黃連素可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1表達(dá)來(lái)上調(diào)miRNA-363表達(dá)。

表5 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miRNA-363表達(dá)水平比較

2.6 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證HNF1A-AS1與miRNA-363之間的靶向關(guān)系

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HNF1A-AS1可以靶向調(diào)控miRNA-363，結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示同時(shí)轉(zhuǎn)染野生型HNF1A-AS1和miRNA-363 模擬物后，相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.13，P=0.003 0，P<0.01)，說(shuō)明HNF1A-AS1和miRNA-363之間具有靶向調(diào)控作用，見(jiàn)表6。

圖2 HNF1A-AS1與miRNA-363的結(jié)合位點(diǎn)

表6 雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果

3 討論

現(xiàn)階段骨肉瘤的主要治療方法包括手術(shù)、化療、免疫療法和基因療法等，然而骨肉瘤的高轉(zhuǎn)移能力和耐藥性仍是預(yù)后不良的主要原因[6]，因此從分子機(jī)制研究骨肉瘤的致病機(jī)制能為患者的早期診斷和晚期預(yù)后提供理論依據(jù)。

近些年研究表明中藥在OS的治療中取得了重大進(jìn)展，如研究發(fā)現(xiàn)柴胡垂盆湯在恢復(fù)食欲、保護(hù)骨肉瘤患者肝功能方面確有良效。另外發(fā)現(xiàn)矮地茶具有保護(hù)OS患者肝細(xì)胞的作用，垂盆草有減輕肝細(xì)胞損傷、降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平的作用。八珍湯可以明顯降低骨肉瘤患者骨髓抑制的發(fā)生率[7]。黃連素是中草藥黃連的主要活性單體，其分子式是C20H19NO5，分子量為353.36，研究顯示黃連素具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗氧化作用，最近研究顯示黃連素可以通過(guò)調(diào)節(jié)caspase-1/IL-1β通路促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡[8]。也有研究顯示黃連素可以通過(guò)調(diào)節(jié)Rad51提高OS細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，進(jìn)一步抑制OS細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]。此外，Chen等[10]的研究結(jié)果也顯示黃連素可以通過(guò)抑制PI3K/Akt途徑發(fā)揮抑制OS的作用。但是關(guān)于黃連素抑制OS的機(jī)制尚不明確。臨床研究顯示HNF1A-AS1在OS中過(guò)表達(dá)，并且高水平的HNF1A-AS1與患者預(yù)后不良有關(guān)[11]。本次研究結(jié)果顯示黃連素可以抑制OS細(xì)胞中HNF1A-AS1的水平，可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1表達(dá)來(lái)抑制OS細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而重新提高HNF1A-AS1的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)黃連素對(duì)OS的抑制作用。這提示黃連素抑制OS的作用可能與抑制HNF1A-AS1的水平有關(guān)。

為進(jìn)一步分析黃連素可能通過(guò)抑制HNF1A-AS1調(diào)控OS的機(jī)制，本研究檢測(cè)了細(xì)胞中miRNA-363的變化。研究表明miRNA-363可以通過(guò)與NOB1結(jié)合抑制OS細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。臨床研究結(jié)果也顯示miRNA-363具有抑制OS的作用[13]。更重要的是，miRNA-363的抗癌功能受到LncRNA的調(diào)控，LncRNA可以像海綿一樣吸附miRNA-363，從而抑制miRNA-363的功能，如LncRNA MALAT1可以通過(guò)靶向抑制miRNA-363促進(jìn)直腸癌的增殖[14]。本研究結(jié)果顯示黃連素可以顯著促進(jìn)miRNA-363的表達(dá)，而提高HNF1A-AS1的水平可以抑制miRNA-363且可以逆轉(zhuǎn)黃連素對(duì)miRNA-363的促進(jìn)作用。此外，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了HNF1A-AS1可以直接靶向miRNA-363。過(guò)往研究顯示HNF1A-AS1可以通過(guò)抑制miRNA發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移的作用[15-16]。也有研究顯示黃連素可以通過(guò)抑制LncRNA CASC2促進(jìn)大腸癌的凋亡[17]。此外，黃連素可以通過(guò)調(diào)節(jié)LncRNA MIAT調(diào)控心肌細(xì)胞的自噬。這提示在OS中，黃連素可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1提高miRNA-363的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制OS的作用。

綜上所述，黃連素可以通過(guò)抑制HNF1A-AS1提高miRNA-363的表達(dá)，并發(fā)揮抑制OS細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)凋亡的作用。關(guān)于黃連素對(duì)OS的抑制作用還需要進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，并且其調(diào)控HNF1A-AS1的機(jī)制也值得深入研究。