姜習(xí)鳳 李光飛 曹國文

骨肉瘤在兒童和年輕人中是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有惡性程度高，疾病進(jìn)展迅速的特點(diǎn)[1]。骨肉瘤起源于間充質(zhì)細(xì)胞，其病理特征是梭形細(xì)胞和異常的骨樣形成。盡管手術(shù)、輔助化療、放療等諸多手段用來治療骨肉瘤，然而骨肉瘤的預(yù)后仍然不太理想，局部病灶患者的5 a生存率約為60%～80%，而轉(zhuǎn)移型患者的生存率則低至15%～30%，并且肺轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致骨肉瘤患者死亡的最常見原因[2]。目前用于人類骨肉瘤治療的化療方案涉及多種化療劑的組合，如高劑量甲氨蝶呤與亞葉酸鈣、多柔比星、順鉑與異環(huán)磷酰胺、依托泊苷等等。這些方案在骨肉瘤的化療中發(fā)揮了重要作用，但對(duì)生存率沒有明顯的改善[3]，因此研制高效低毒的抗骨肉瘤藥物仍然是當(dāng)前骨肉瘤研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

在新型抗腫瘤藥物的研究中，天然產(chǎn)物已獲得相當(dāng)多的關(guān)注。蛇床子素(Osthole)作為中藥蛇床子中含量最高的香豆素類化合物，已有報(bào)道顯示其對(duì)心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有良好的作用，并能以劑量依賴性抑制人膽囊癌、三陰性乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，誘導(dǎo)凋亡[4-5]?，F(xiàn)有研究表明蛇床子素能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[6]，但尚未闡明蛇床子素在骨肉瘤侵襲和遷移過程中的作用及其潛在作用機(jī)制，因此本研究擬初步探索蛇床子素對(duì)骨肉瘤增殖、遷移和侵襲的抑制作用及其潛在的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS為本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于DMEM(高糖)培養(yǎng)基。置培養(yǎng)箱內(nèi)5% CO2、37 ℃下常規(guī)培養(yǎng)，2 d換液1次，3～4 d傳代1次。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

蛇床子素購于上海詩丹德生物公司，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，用DMEM(高糖)培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。DMEM(高糖)培養(yǎng)基購自HyClone公司；胎牛血清購自GIBCO公司；胰酶(Trypsin)購自BIOSHARP公司；瑞-姬氏染液購自南京建成科技有限公司；M-per蛋白裂解液、ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司；MTT試劑盒購自上海碧云天生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；PTEN、pAKT、AKT和GAPDH抗體購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 96孔板中每孔接種合適數(shù)量的人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，同時(shí)分別加入不同濃度(20～200 μmol/L)的蛇床子素，對(duì)照組加入含0.2% DMSO的培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)44 h后，以10 μL/孔加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入DMSO 100 μL充分振蕩使結(jié)晶充分溶解。在酶標(biāo)儀上測定熒光OD 570 nm的吸光度值，并按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[7]計(jì)算出抑制率和半數(shù)抑制濃度，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.2克隆形成實(shí)驗(yàn) 消化U2-OS細(xì)胞，以細(xì)胞密度1 000個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，十字法使其均勻分布，待24 h細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組加入含0.2% DMSO的培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入含160 μmol/L蛇床子素的DMEM培養(yǎng)基，作用24 h后全部換成DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每2 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)培養(yǎng)基中出現(xiàn)肉眼可見克隆且顯微鏡下可見單個(gè)克隆集落細(xì)胞計(jì)數(shù)大于50時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，用瑞-姬氏染液進(jìn)行染色，蒸餾水洗凈干燥后倒置顯微鏡拍照觀察計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的U2-OS細(xì)胞種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用無菌的200 μL槍頭垂直于板底直線劃痕，PBS清洗3遍后加入含不同濃度蛇床子素的無血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于0 h及24 h取樣拍照，記錄各組細(xì)胞劃痕寬度，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠置于冰上，用無血清DMEM培養(yǎng)基以1∶7稀釋，取25 μL加入Transwell上室膜上鋪平，37 ℃培養(yǎng)箱靜置30 min待其凝固，使用前先用無血清培養(yǎng)基浸潤上室膜。在各組U2-OS細(xì)胞培養(yǎng)48 h后消化離心，用無血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，分別加入1×105個(gè)細(xì)胞，下室加入DMEM完全培養(yǎng)基。孵育24 h后，用棉簽擦去小室內(nèi)表面未遷移的細(xì)胞，PBS洗3次，瑞-姬氏染液染色，風(fēng)干后用中性樹脂封片顯微鏡拍照，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.5Western Blot法檢測蛋白表達(dá) 將U2-OS細(xì)胞以2×105個(gè)/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞密度到達(dá)80%后給藥，加入不同濃度的蛇床子素作用，48 h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入M-per蛋白裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃、12 000 r/min下離心15 min去上清，用BCA法測定蛋白濃度并調(diào)平，加入上樣緩沖液于95 ℃變形3～5 min。10%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉后孵育一抗4 ℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯像后于暗室曝光。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖的作用

用0、20、40、80、120、160、200 μmol/L濃度的蛇床子素作用于人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞48 h后，MTT結(jié)果如圖1和表1所示，隨著劑量的增加，蛇床子素對(duì)U2-OS細(xì)胞活力的抑制作用逐漸增強(qiáng)，說明蛇床子素抑制骨肉瘤的作用具有劑量依賴性，48 h的半數(shù)抑制濃度為97.084 μmol/L。

圖1 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖的作用(MTT方法，**與0 μmol/L組相比，P<0.01)

表1 不同濃度蛇床子素處理后對(duì)人U2-OS增殖的影響

2.2 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS克隆形成的作用

不同濃度的蛇床子素作用后，細(xì)胞平板克隆形成率較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且隨著蛇床子素濃度的升高，U2-OS細(xì)胞平板克隆形成率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS克隆形成的作用(**與0 μmol/L組相比，P<0.01)

2.3 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS遷移的作用

通過比較對(duì)照組和給藥組細(xì)胞傷口愈合程度來判斷遷移能力，以0 h作為對(duì)照，在24 h分別觀察其遷移情況(如圖3a所示)，160 μmol/L的蛇床子素能顯著抑制細(xì)胞U2-OS的遷移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3b。

圖3 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS遷移的作用

2.4 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS侵襲的作用

與對(duì)照組相比，高濃度的蛇床子素作用U2-OS細(xì)胞48 h后，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，侵襲受到顯著抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

圖4 蛇床子素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS侵襲的作用

2.5 蛇床子素對(duì)U2-OS細(xì)胞PTEN/AKT信號(hào)通路的作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證蛇床子素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖和遷移的抑制作用，采用Western Blot方法檢測了相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。與0 μmol/L組相比，不同濃度的蛇床子素作用后，細(xì)胞內(nèi)PTEN蛋白表達(dá)水平顯著上升，高濃度組上升最為明顯；pAKT的表達(dá)水平顯著下降，高濃度組下降最為明顯，見圖5和表2。

表2 蛇床子素對(duì)PTEN、pAKT和AKT蛋白表達(dá)的作用

圖5 蛇床子素對(duì)PTEN/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨肉瘤是最常見的惡性骨腫瘤。雖然骨肉瘤是一種對(duì)某些化療藥物具有敏感性的腫瘤，但癌細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生耐藥性，并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的趨勢，主要是在肺部。轉(zhuǎn)移與侵襲是惡性腫瘤療效欠佳、預(yù)后較差的主要原因，直接導(dǎo)致腫瘤患者死亡。因此，尋求高療效、低毒性、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物具有極其重要的臨床意義。蛇床子素是從蛇床子等植物中提取出來的香豆素類化合物，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等多種抗腫瘤作用[8]。研究表明，蛇床子素通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[9]。Abosharaf等[10]利用不同濃度的蛇床子素作用人肺腺癌細(xì)胞A549后發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可以通過抑制組蛋白去乙?；竵碚T導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究檢測了不同濃度的蛇床子素對(duì)人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，發(fā)現(xiàn)蛇床子素能有效地抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為蛇床子素的深入研究和抗癌藥物研發(fā)提供了理論依據(jù)。

骨肉瘤是一種遺傳性不穩(wěn)定的實(shí)體腫瘤，核型高度復(fù)雜，染色體結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變化頻率高，在這些基因組的改變中，磷酸酶和緊張素同源基因(PTEN)是最常見的改變基因之一[11]。PTEN是一種重要的腫瘤抑制因子，其蛋白產(chǎn)物具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的活性，可以通過去磷酸化參與細(xì)胞調(diào)控。在體內(nèi)和體外，PTEN特異性剪切PIP3磷酸鹽，PTEN是PI3K/Akt信號(hào)通路的主要負(fù)調(diào)控因子，在多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用[12]。有報(bào)道稱在轉(zhuǎn)染miR-92a的骨肉瘤細(xì)胞中，過表達(dá) PTEN可增加G0/G1期細(xì)胞的數(shù)量，并誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[13]。此外，PTEN還可以增加BAD的磷酸化或過表達(dá)AKT相關(guān)的凋亡蛋白來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡抑制其增殖。PTEN在阻止骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中也發(fā)揮著重要作用。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)被認(rèn)為是侵襲-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)的初始過程，因?yàn)樗x予癌細(xì)胞遷移和侵襲的特性。研究表明引入PTEN基因后β-catenin及波形蛋白的表達(dá)量極大地下調(diào)，E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，表明PTEN可以部分地抑制骨肉瘤細(xì)胞HOS58的EMT進(jìn)程[14]。此外，上調(diào)PTEN的表達(dá)還會(huì)減少AKT的磷酸化，提示PTEN可能通過AKT通路抑制EMT從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。利用Western Blot法檢測PTEN、pAKT和AKT的蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示蛇床子素處理人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS后，隨著蛇床子素劑量的增加，U-2OS細(xì)胞中PTEN蛋白的條帶逐漸變亮，而pAKT蛋白的條帶逐漸變淺，可見其能濃度依賴性地上調(diào)U-2OS細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)且下調(diào)pAKT蛋白的表達(dá)。因此，筆者推測蛇床子素能夠通過調(diào)控PTEN-AKT通路來抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素不僅可以抑制骨肉瘤的增殖，還通過調(diào)控PTEN-AKT通路達(dá)到較好地抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，對(duì)轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的治療具有潛在的應(yīng)用前景。