王菊寧，霍宇寧，任淑婷

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西西安 710061；2.西安培華學(xué)院，陜西西安 710125）

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）發(fā)病過程中最常見、最嚴重的并發(fā)癥之一[1]，其主要病理改變之一是腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的增多最終導(dǎo)致的腎小球硬化。高血糖是引發(fā)DN發(fā)生和發(fā)展的主要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，硒具有類胰島素樣作用，能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運體的活性，促進靶組織利用葡萄糖，在降血糖的同時不增加血液中的胰島素水平[2]。本研究擬探討胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉在高糖環(huán)境下對腎小球系膜細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人腎小球系膜細胞株（Human Mesangial Cell，HMC），西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科付榮國教授提供；胰島素，徐州萬邦金橋制藥有限公司；亞硒酸鈉，西安赫特生物公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），以色列 Biological Industries；DMEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；細胞計數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK8），碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、甘露醇、二甲亞砜，美國Sigma。

1.2 細胞培養(yǎng)

復(fù)蘇HMC進行培養(yǎng)，制備0.5×105cell/mL的HMC細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細胞完全貼壁后更換含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步化，然后再給予細胞不同處理。

1.3 葡萄糖誘導(dǎo)HMC增殖模型的建立

采用濃度為 0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、30 mmol/L 和35 mmol/L的葡萄糖溶液處理HMC細胞，觀察處理24 h后細胞增殖情況確定誘導(dǎo)HMC增殖的最佳葡萄糖濃度。為了觀察高糖引起溶液滲透壓增高后是否對細胞增殖有影響，除未給予任何處理的正常對照組（Control）外，同時增設(shè)與最佳葡萄糖濃度相當?shù)?0 mmol/L高滲甘露醇組（Mannitol），觀察HMC在葡萄糖和高滲甘露醇作用下48 h內(nèi)的增殖情況。

1.4 胰島素或胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉抑制HMC增殖

為了明確胰島素對高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制作用及其最佳抑制劑量，以未給予任何處理的空白對照組（Control）和30 mmol/L甘露醇處理的高滲甘露醇組（Mannitol）作陰性對照，在最佳葡萄糖濃度誘導(dǎo)HMC增殖的條件下，再給予3個不同濃度（30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL）的胰島素處理，與葡萄糖單獨處理的高糖模型組（Glucose）比較，觀察胰島素對高糖誘導(dǎo)48 h內(nèi)細胞增殖的抑制作用，篩選出胰島素對高糖誘導(dǎo)HMC增殖抑制作用的最佳處理濃度。

在得到最佳胰島素處理濃度后，基于以往對胰島素與亞硒酸鈉的最佳配伍研究[3]，分別給予最佳濃度胰島素單獨處理（Insulin）、或胰島素與相應(yīng)濃度亞硒酸鈉聯(lián)用處理（Insulin+Sodium Selenite）高糖誘導(dǎo)后的HMC，觀察胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對高糖誘導(dǎo)48 h內(nèi)細胞增殖的抑制效果。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖

細胞培養(yǎng)不同時間點后棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 不同新培養(yǎng)基和10 基和同時間點后溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism 5 XML Project軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。各組間比較利用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖誘導(dǎo)HMC的增殖

通過檢測細胞活性，明確高糖對HMC的增殖作用。用不同濃度的葡萄糖處理HMC 24 h后，檢測HMC的相對細胞活性，結(jié)果如圖1a所示。隨著葡萄糖濃度（5～35 mmol/L）的增加，相對細胞活性均較正常對照組（0 mmol/L Glucose）顯著增加（P＜0.05）；且當葡萄糖濃度為30 mmol/L時，細胞相對活性達到峰值。因此，后續(xù)研究選用30 mmol/L葡萄糖作為誘導(dǎo)HMC增殖的最佳濃度。

以未給予任何處理的細胞作為正常對照組（Control），檢測30 mmol/L葡萄糖（Glucose）和甘露醇（Mannitol）誘導(dǎo)不同時間對HMC相對細胞活性的影響，結(jié)果如圖1b所示。與正常對照組和高滲甘露醇組相比，高糖（30 mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)HMC 24 h、36 h和48 h的相對細胞活力均顯著性上升（P＜0.05），且呈時間依賴性；而高滲甘露醇組與正常對照組相比，其相對細胞活力無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 高糖誘導(dǎo)HMC增殖情況

2.2 胰島素或胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對高糖環(huán)境下HMC增殖的影響

如圖2a和2b所示，胰島素處理后24 h和48 h，與高糖模型組（Glucose）比較，3個不同濃度胰島素處理組的相對細胞活力均顯著性降低（P＜0.05），其中100 mU/mL胰島素組的細胞活力最低，提示胰島素可有效抑制高糖誘導(dǎo)HMC的增殖，且以100 mU/mL胰島素處理組的抑制效果最明顯。

圖2 胰島素對高糖誘導(dǎo)HMC增殖的影響

基于以往對胰島素與亞硒酸鈉的最佳配伍研究[3]，選擇100 mU/mL胰島素聯(lián)合500 ng/mL亞硒酸鈉作為胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉實驗的藥物濃度。圖3結(jié)果顯示，隨著處理時間的延長，與高糖模型組（Glucose）相比，100 mU/mL胰島素處理組（Insulin）和100 mU/mL胰島素+500 ng/mL亞硒酸鈉處理組（Insulin + Sodium Selenite）的相對細胞活力均明顯下降（24 h、36 h、48 h均P＜0.05）；與單獨胰島素處理組（Insulin）相比，胰島素+亞硒酸鈉組（Insulin + Sodium Selenite）的相對細胞活力降低更顯著（48 h，P＜0.05）。由此可見，胰島素及胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉均可顯著抑制高糖環(huán)境下HMC的異常增殖，而胰島素聯(lián)合亞硒酸的抑制效果優(yōu)于同等劑量單獨胰島素。

圖3 胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉對高糖誘導(dǎo)HMC增殖的影響

3 結(jié)論

腎小球系膜細胞的異常增殖是DN的一個重要病理特征。本研究證實，30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)HMC的細胞增殖顯著且具有時間依賴性，而不同濃度（30 mU/mL、100 mU/mL、300 mU/mL） 的 胰 島素可顯著抑制高糖誘導(dǎo)HMC的異常增殖，使細胞活性顯著下降，其中100 mU/mL胰島素對高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制效果最為顯著，該濃度胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉按1∶5使用后，對高糖誘導(dǎo)HMC增殖的抑制效果更加顯著，提示胰島素聯(lián)合亞硒酸鈉可能會對糖尿病腎病引起的腎小球硬化具有重要的防治作用。