劉其則,陳忠蔭,呂金更,王 強(qiáng),杜 宇,林熾賢

(海南熱帶海洋學(xué)院 a.水產(chǎn)與生命學(xué)院;b.海南省兩棲爬行動(dòng)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 三亞,572022)

0 引言

蛇毒是有毒蛇類(lèi)毒腺分泌的混合物,是在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生用于捕食獵物的重要武器,使得蛇類(lèi)的捕食模式由依靠機(jī)械力向利用化學(xué)力轉(zhuǎn)變[1]。盡管毒液儲(chǔ)量占毒蛇體質(zhì)量極小的比例,但其生成過(guò)程往往需要代謝耗能以及一定的時(shí)間周期[2]818,[3]120,[4]32,[5]。因此,蛇毒又是有毒蛇類(lèi)珍貴的化學(xué)武器,動(dòng)物必須考慮優(yōu)化使用[3]121。一般毒蛇的毒液儲(chǔ)量可由排毒量指標(biāo)(排毒量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量)進(jìn)行衡量,這3個(gè)指標(biāo)往往受到毒蛇分類(lèi)地位、地理分布、形態(tài)、年齡、性別、生理狀態(tài)、毒牙間距、季節(jié)、溫度、生境、食性和采毒頻率等因素的影響[4]32,[6-7],[8]22。研究毒蛇的排毒量特征及影響因素,可間接衡量其潛在注入攻擊對(duì)象體內(nèi)的毒液量以及蛇傷危害程度,也可為蛇毒的開(kāi)發(fā)利用提供參考[4]33。

中國(guó)地域遼闊,毒蛇資源豐富,其中海洋產(chǎn)毒蛇16種[9]。大多數(shù)海蛇性情溫和,只有被激怒時(shí)才會(huì)攻擊,與陸生毒蛇相比,海蛇傷人的發(fā)病率非常低[10]。人類(lèi)在熱帶海洋捕撈時(shí),海蛇常常會(huì)作為副產(chǎn)物隨著漁獲被捕撈上船,漁民在處理捕獲物時(shí)就很容易被海蛇咬傷,因此超過(guò)一半的海蛇致傷病例與海洋捕撈作業(yè)有關(guān)[11]58,[12-13]。據(jù)統(tǒng)計(jì),海蛇攻擊人類(lèi)的事件中,有20%的病患體內(nèi)被明顯注入毒液,并導(dǎo)致3%的死亡率[11]59。如果患者未得到有效治療或緊急處理,死亡率甚至可高達(dá)50%[14]118。海蛇咬傷容易引發(fā)患者全身性癥狀,如癱瘓、視力模糊、呼吸衰竭和肌肉壞死等,這些臨床表現(xiàn)主要是由其中的神經(jīng)毒素和磷脂酶A2所造成的[11]60,[14]120。青環(huán)海蛇(Hydrophiscyanocinctus)和平頦海蛇(Hydrophiscurtus)作為國(guó)內(nèi)分布較廣、資源保有量相對(duì)較多的2種海蛇,其毒液的毒性大,致死性高,對(duì)海洋作業(yè)及海邊旅游帶來(lái)較大的危害。然而,國(guó)內(nèi)有關(guān)這2種毒蛇的排毒量特征及其與形態(tài)、性別等相關(guān)性研究的工作匱乏。

本研究以青環(huán)海蛇和平頦海蛇為對(duì)象,測(cè)定其排毒量特征(鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量),并結(jié)合形態(tài)特征(頭長(zhǎng)、頭寬、頭體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)和體質(zhì)重),探討排毒量特征的種間差異及其與形態(tài)特征之間的相關(guān)性,以期為2種海蛇所致蛇傷的臨床治療、抗蛇毒血清研制和蛇毒天然活性藥物開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與蛇毒提取

實(shí)驗(yàn)用青環(huán)海蛇147條和平頦海蛇114條各采自中國(guó)南海海域,動(dòng)物采集后飼養(yǎng)于海南省兩棲爬行動(dòng)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室循環(huán)海水馴養(yǎng)池,定期投飼冰凍或活體的鰻鱺目(Anguilliformes)魚(yú)類(lèi),每天噴淋淡水15 min。取毒前動(dòng)物至少禁食一周后,用套管法采集毒液[15],同一個(gè)體左右毒牙收集的毒液經(jīng)合并后轉(zhuǎn)入凍存管。新鮮蛇毒經(jīng)冷凍干燥后存放至-80 ℃超低溫冰箱。用數(shù)顯游標(biāo)卡尺和卷尺測(cè)量并記錄動(dòng)物頭長(zhǎng)(Head length,HL)lH、頭寬(Head width,HW)wH、頭體長(zhǎng)(Snout-vent length,SVL)lSV和尾長(zhǎng)(Tail length,TL)lT,用電子秤稱(chēng)量動(dòng)物體質(zhì)量(Body mass,BM)mB,并記錄動(dòng)物性別。稱(chēng)量并計(jì)算每條個(gè)體的排毒量鮮質(zhì)量(Wet mass,WM)mW和干質(zhì)量(Dry mass,DM)mD,用mD/mW×100 %作為干物質(zhì)含量(Solid content,SC)cS。

1.2 數(shù)據(jù)分析

由于取毒失誤、動(dòng)物自咬或咬其他蛇等因素,導(dǎo)致部分樣本的排毒量指標(biāo)不準(zhǔn)確,相應(yīng)數(shù)據(jù)被剔除,最終70條青環(huán)海蛇和75條平頦海蛇的排毒量指標(biāo)被用于統(tǒng)計(jì)分析?？紤]到雌性個(gè)體在飼養(yǎng)過(guò)程中有懷孕現(xiàn)象,故不分析海蛇成體排毒量是否與BM有關(guān)。統(tǒng)計(jì)分析前,所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn),用方差分析(ANOVA)、協(xié)方差分析(ANCOVA)和直線(xiàn)回歸分析處理數(shù)據(jù)。用lH/lSV表示相對(duì)頭長(zhǎng),用wH/lSV表示相對(duì)頭寬,以此去除頭體長(zhǎng)對(duì)頭部的影響,檢測(cè)排毒量分別與頭長(zhǎng)及頭寬之間的關(guān)系。描述性統(tǒng)計(jì)值使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤和最小值—最大值表示,顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 青環(huán)海蛇和平頦海蛇的形態(tài)特征

青環(huán)海蛇雌雄最大個(gè)體的SVL分別為148.8 cm和153.1 cm,平頦海蛇雌雄最大個(gè)體的SVL則分別為76.8 cm和 77.9 cm,青環(huán)海蛇的平均SVL(122.05 cm VS 69.25 cm)顯著大于平頦海蛇(單因子ANOVA,F1,143=913.39,P<0.000 1),2種海蛇的平均SVL均無(wú)兩性差異(allP>0.1)(表1)。2種海蛇SVL的頻次分布均符合正態(tài)分布(Kolmogorov-Smirnov test,allP>0.05)(圖1)。以SVL為協(xié)變量,性別為因子的單因子ANCOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),1)特定SVL為122 cm時(shí),雄性青環(huán)海蛇的矯正平均TL(10.29 cm VS 9.61cm)顯著大于雌性(P<0.05),而HL和HW均無(wú)兩性差異(allP>0.1)(表2)。特定SVL為69 cm時(shí),雌性平頦海蛇的矯正平均HW(2.06 cm VS 1.73 cm)顯著大于雄性(P<0.000 1),而TL和HL均無(wú)兩性差異(allP>0.1)(表1)。以SVL為協(xié)變量,物種為因子的單因子ANCOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2種海蛇的TL(F1,142=10.88,P<0.01)、HL(F1,142=314.12,P<0.001)和HW(F1,142=117.51,P<0.001)存在顯著的種間差異;特定SVL為95 cm時(shí),平頦海蛇的矯正平均TL(9.62 cm VS 8.27 cm)、HL(3.99 cm VS 2.46 cm)和HW(2.34 cm VS 1.08 cm)均顯著大于青環(huán)海蛇。

H.cyanocinctus:青環(huán)海蛇;H.curtus:平頦海蛇;Females:雌性;Males:雄性。圖1 青環(huán)海蛇和平頦海蛇頭體長(zhǎng)頻次分布

表1 青環(huán)海蛇和平頦海蛇形態(tài)特征及排毒量的描述性統(tǒng)計(jì)值及統(tǒng)計(jì)分析

注:描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤和最小值～最大值表示,顯著性水平設(shè)為α= 0.05。頭體長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及干物質(zhì)含量的兩性間比較:用單因子ANOVA分析。體質(zhì)量、尾長(zhǎng)、頭長(zhǎng)及頭寬的兩性間比較:以頭體長(zhǎng)為協(xié)變量,用單因子ANCOVA分析。

2.2 海蛇排毒量與其形態(tài)特征的相關(guān)性

青環(huán)海蛇雌性和雄性排毒量的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量分別為43.18 mg和33.36 mg、9.14 mg和8.05 mg、21.51 %和25.01%,平頦海蛇雌性和雄性排毒量的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量分別為33.16 mg和34.71 mg、4.40 mg和5.30 mg、13.30 %和15.05%;單因子 ANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2種海蛇排毒量的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量均無(wú)兩性差異(allP>0.05)(表1)。

線(xiàn)性回歸分析發(fā)現(xiàn),青環(huán)海蛇排毒量的鮮質(zhì)量(mW=-23.24+0.53lSV,R2=0.15,F1,68=11.50,P<0.01;mW=-18.13+19.37lH,R2=0.13,F1,68=10.40,P<0.01;mW=16.38+16.77wH,R2=0.07,F1,68=4.79,P= 0.03)分別與SVL、HL和HW之間呈顯著的正相關(guān);干質(zhì)量(mD=-2.28+0.09lSV,R2=0.08,F1,68=5.51,P= 0.02;mD=-1.62+3.44lH,R2=0.07,F1,68=5.27,P<0.05)分別與SVL和HL之間呈顯著的正相關(guān),而干質(zhì)量(mD=7.97+0.64wH,R2=0.002,F1,68=0.11,P= 0.74)與HW無(wú)關(guān);干物質(zhì)含量(cS=34.63-0.10lSV,R2=0.06,F1,68=4.03,P= 0.05;cS=32.66-3.41lH,R2=0.04,F1,68=3.05,P= 0.09)分別與SVL 和HL無(wú)關(guān),而干物質(zhì)含量(cS=34.69-8.43wH,R2=0.17,F1,68=14.29,P<0.001)與和HW之間呈顯著的負(fù)相關(guān)?？紤]到頭體長(zhǎng)與頭部形態(tài)之間的相關(guān)性,我們?nèi)コ祟^體長(zhǎng)的影響,線(xiàn)性回歸分析相對(duì)頭長(zhǎng)和相對(duì)頭寬與排毒量指標(biāo)之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示青環(huán)海蛇排毒量的鮮質(zhì)量(mW=49.85-343.04lH,R2=0.001,F1,68=0.07,P= 0.79;mW=32.06+758.29wH,R2=0.004,F1,68=0.30,P= 0.58)和干質(zhì)量(mD=9.86-37.10lH,R2=0.0002,F1,68=0.01,P= 0.90;mD=13.95-415.96wH,R2=0.02,F1,68=1.59,P= 0.21)與頭長(zhǎng)和頭寬無(wú)關(guān),干物質(zhì)含量(cS=17.72-178.23lH,R2=0.003,F1,68=0.20,P= 0.65)與頭長(zhǎng)無(wú)關(guān),但仍與頭寬呈負(fù)相關(guān)(cS=39.49-1430.34wH,R2=0.16,F1,68=13.35,P<0.001)。

線(xiàn)性回歸分析發(fā)現(xiàn),平頦海蛇排毒量的鮮質(zhì)量(mW=-62.31+1.39lSV,R2=0.11,F1,73=8.54,P<0.01;mW=-60.62+27.56lH,R2=0.10,F1,73=7.64,P<0.01)分別與SVL和HL之間呈顯著的正相關(guān),而鮮質(zhì)量(mW=44.95-5.76wH,R2=0.01,F1,73=0.62,P= 0.44)與HW無(wú)關(guān);干質(zhì)量(mD=-13.35+0.26lSV,R2=0.14,F1,73=11.42,P<0.01;mD=-12.77+5.10lH,R2=0.12,F1,73=9.85,P<0.01)分別與SVL和HL之間呈顯著的正相關(guān),而干質(zhì)量(mD=10.18-2.80wH,R2=0.07,F1,73=5.70,P= 0.02)與HW之間顯著的負(fù)相關(guān);干物質(zhì)含量(cS=1.14+0.18lSV,R2=0.03,F1,73=1.84,P= 0.18;cS=1.16+3.71lH,R2=0.02,F1,73=1.72,P= 0.19)分別與SVL和HL無(wú)關(guān),而干物質(zhì)含量(cS=25.53-5.95wH,R2=0.12,F1,73=9.87,P<0.01)與HW之間顯著的負(fù)相關(guān).考慮到頭體長(zhǎng)與頭部形態(tài)之間的相關(guān)性,去除了頭體長(zhǎng)的影響。線(xiàn)性回歸分析相對(duì)頭長(zhǎng)和相對(duì)頭寬與排毒量指標(biāo)之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示，平頦海蛇排毒量的鮮質(zhì)量(mW=45.72-243.68lH,R2=0.0009,F1,73=0.06,P= 0.80;mW=59.72-918.27wH,R2=0.05,F1,73=3.60,P= 0.06)與頭長(zhǎng)和頭寬無(wú)關(guān),干質(zhì)量(mD=7.55-57.88lH,R2=0.002,F1,73=0.13,P= 0.72)和干物質(zhì)含量(cS=15.61-35.35lH,R2=0.0003,F1,73=0.02,P= 0.89)與頭長(zhǎng)無(wú)關(guān),但仍與頭寬呈負(fù)相關(guān)(mD=12.78-285.11wH,R2=0.17,F1,73=14.52,P<0.001;cS=27.07-465.48wH,R2=0.16,F1,73=14.05,P<0.001)。

2.3 海蛇排毒量的種間比較

單因子 ANOVA檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2種海蛇排毒量的鮮質(zhì)量(F1,143=5.52,P<0.05)、干質(zhì)量(F1,143=39.98,P<0.000 1)和干物質(zhì)含量(F1,143=78.56,P<0.000 1)存在顯著的種間差異,青環(huán)海蛇排毒量的平均鮮質(zhì)量(41.21 mg VS 33.66 mg)、干質(zhì)量(8.92 mg VS 4.69 mg)和干物質(zhì)含量(22.21 % VS 13.86 %)均顯著大于平頦海蛇。

3 討論

一般常采用咬膜皿法和套管法對(duì)毒蛇進(jìn)行無(wú)損傷采集毒液,可依據(jù)毒腺毒量的物種屬性選用相應(yīng)的采集方法[4]34,[15]。由于海蛇毒量較少,本研究采用了套管法并用手按摩毒腺的方式獲取青環(huán)海蛇和平頦海蛇毒液,可以減少蛇體口腔分泌物對(duì)蛇毒的污染,并最大限度降低了蛇毒的損耗。采毒頻率提高或短時(shí)間內(nèi)持續(xù)排毒顯著影響毒蛇的毒液產(chǎn)量。如對(duì)國(guó)產(chǎn)8種陸生毒蛇排毒量研究中發(fā)現(xiàn),取毒周期越短,毒量越少[16]。檢測(cè)短尾蝮在短時(shí)間內(nèi)5次連續(xù)自主咬物的排毒量發(fā)現(xiàn),其首次咬物釋放毒液的干質(zhì)量占排毒量總干質(zhì)量的57.7%,隨著排毒序次的遞增,毒量逐漸降低[17]。毒蛇在排毒后至毒腺中毒液再次充滿(mǎn)需要一定的時(shí)間[2]819,因此取毒不能過(guò)于頻繁,一般考慮至少間隔20 d,以免影響蛇毒品質(zhì)及造成蛇體負(fù)擔(dān)。此外,采毒前應(yīng)至少禁食7 d以上,以防進(jìn)食釋放毒液影響排毒量的準(zhǔn)確性。2種海蛇的獲取與采集時(shí)間也充分考慮了上述因素。

某些毒蛇的形態(tài)呈現(xiàn)顯著的兩性差異,其毒液產(chǎn)量也呈現(xiàn)相關(guān)聯(lián)的變化。如棕樹(shù)蛇(Pseudonajatextilis)雄性體長(zhǎng)明顯較雌性長(zhǎng),舟山眼鏡蛇雄性頭長(zhǎng)、頭寬大于雌性,雄性的排毒量要明顯高于雌性;美洲矛頭蝮(Bothropsjararaca)剛好相反,3年齡雌性體長(zhǎng)為雄性的1.5倍,其泌毒量為雄性的近10倍

[4]32,[18]1581,[19]。這應(yīng)與兩性在生存過(guò)程中能量需求差異有關(guān),任何一種性別維持較大體型或雌性需要進(jìn)行繁殖都需要額外的能量投入,因此,強(qiáng)化排毒量有助于其捕獲較多、較大的獵物。本研究中,因2種海蛇部分雌性個(gè)體處于懷卵狀態(tài),體質(zhì)量的兩性差異不足以解釋二者對(duì)排毒量的影響,且尾長(zhǎng)對(duì)排毒量亦不存在直接貢獻(xiàn),故不探討這2個(gè)形態(tài)指標(biāo)與排毒量之間的關(guān)系。除平頦海蛇的頭寬存在性別差異外,2種海蛇其余形態(tài)特征均無(wú)性別差異,可能預(yù)示了兩性個(gè)體的排毒量差異將不會(huì)太大,統(tǒng)計(jì)結(jié)果也驗(yàn)證了排毒量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量不存在性別差異。

不少研究認(rèn)為毒蛇的排毒量與形態(tài)特征(個(gè)體大小、體質(zhì)量、頭長(zhǎng)和頭寬)顯著相關(guān)。如阿根廷的美麗矛頭蝮(Bothropsalternatus)和北方黑尾響尾蛇(Crotalusdurissusterrificus)的排毒量干質(zhì)量隨著體長(zhǎng)的增加而增加[8]23。國(guó)產(chǎn)舟山眼鏡蛇(Najaatra)的排毒量干質(zhì)量隨著頭體長(zhǎng)、體質(zhì)量、頭長(zhǎng)和頭寬的增加而增加,去除頭體長(zhǎng)的影響,排毒量干質(zhì)量不受相對(duì)體質(zhì)量、相對(duì)頭寬的影響,但仍與相對(duì)頭長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)[4]40。由于取樣較少或樣本間形態(tài)特征的變異度較小,有可能導(dǎo)致這種相關(guān)性不是很顯著[18]1582。盡管本研究所檢測(cè)2種海蛇的排毒量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量與頭寬的相關(guān)性不是很一致,但與頭體長(zhǎng)和頭長(zhǎng)存在顯著的正相關(guān),驗(yàn)證了毒蛇排毒量受主要形態(tài)特征的影響;去除頭體長(zhǎng)影響后,頭部大小(相對(duì)頭長(zhǎng)、頭寬)與排毒量不存在相關(guān)性或相關(guān)性降低,表明頭部大小與排毒量之間的相關(guān)性是頭體長(zhǎng)影響頭部形態(tài)的間接結(jié)果。體型較大毒蛇維持自身的能量需求相對(duì)較大,可能捕食較大、較多的獵物,因而需要釋放較多的毒液以征服獵物[4]32,[18]1581。本研究中,青環(huán)海蛇的排毒量鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均大于平頦海蛇,加之其頭體長(zhǎng)和體質(zhì)量均比平頦海蛇約大一倍,推測(cè)青環(huán)海蛇可能比平頦海蛇捕食較大、較多的獵物。干物質(zhì)含量越高,意味著毒液越黏稠,其在獵物體內(nèi)的擴(kuò)散速度也越慢,青環(huán)海蛇毒的干物質(zhì)含量要高于平頦海蛇,意味著其要快速征服獵物,需有較高的毒量或毒性。

總體而言,2種海蛇排毒量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量與頭體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)均存在顯著的正相關(guān);青環(huán)海蛇排毒量鮮質(zhì)量與頭寬呈正相關(guān),但與干質(zhì)量無(wú)關(guān);平頦海蛇排毒量鮮質(zhì)量與頭寬無(wú)關(guān),但與干質(zhì)量呈負(fù)相關(guān);干物質(zhì)含量與頭體長(zhǎng)、頭長(zhǎng)無(wú)關(guān),與頭寬呈負(fù)相關(guān)。2種海蛇的3個(gè)排毒量指標(biāo)均不存在性別差異。2種海蛇排毒量鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)含量存在顯著的種間差異。排毒量差異的探討可為抗海蛇毒血清制備所需蛇毒原料采集和海蛇咬傷診療提供一定的參考。